2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的異種移植被認(rèn)為是有潛力的解決器官供源不足的方法,但異種移植面臨的免疫排斥比同種異體移植更復(fù)雜,移植物抗宿主病(GVHD)更為嚴(yán)重。我們應(yīng)用大鼠-小鼠造血嵌和體模型,進(jìn)一步研究反向骨髓移植對aGVHD的預(yù)防機(jī)制。 方法1、異種骨髓嵌合體模型的建立:術(shù)前5天SD大鼠(8~10周齡,雌性,SPF級)開始飲含紅霉素(250mg/L)和慶大霉素(320mg/L)抗生素溶液凈化腸道。無菌條件下取BALB/C小鼠(8~10周齡,雌性,SP

2、F級)的骨髓細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,SD大鼠接受7.5Gy(照射率0.5Gy/min)全身照射(TBI)后4小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入上述BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞2×108/只,48小時(shí)后腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg(此預(yù)處理方案為非清髓性),將該嵌合了BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞的供體大鼠飼養(yǎng)30天后,檢測外周血嵌合率,并做皮片移植,結(jié)果證實(shí)小鼠源性骨髓已在大鼠體內(nèi)植活,并誘導(dǎo)出對BALB/c小鼠的特異性耐受。再將該嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞移植到

3、目標(biāo)受體(BALB/C小鼠)。 2、實(shí)驗(yàn)分組:A,B,C組以BALB/C(8~10周齡,雌性,SPF級)小鼠為受鼠,D組以無關(guān)第3者B6小鼠為受鼠,腸道凈化后接受9Gy60Coγ射線致死性TBI:A組經(jīng)尾靜脈輸注正常SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只;B組經(jīng)尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只;C組經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水;D組經(jīng)尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只。觀察各組小鼠aGVHD的臨床表現(xiàn)及生存時(shí)間,

4、瀕死小鼠做病理分析。移植后15天測定TNF-α、INF-γ與IL-4的產(chǎn)量,移植后30天做混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和皮片移植,并追蹤移植后小鼠嵌合率的變化。3、各組小鼠的GVHD評分及生存時(shí)間:評價(jià)GVHD包括5個(gè)參數(shù):體重下降,弓背體態(tài),活動度,皮毛質(zhì)地,皮膚完整度。分析時(shí)每一項(xiàng)都有0-2個(gè)等級。評分為5項(xiàng)參數(shù)的分?jǐn)?shù)總和,最高為10分。評分>5分屬于重度GVHD,3-5分屬于中度GVHD,每周評分一次。每隔一定時(shí)間檢驗(yàn)外周血WBC計(jì)數(shù);并且比

5、較四組小鼠平均存活時(shí)間(MST)。 4、皮膚移植取SD大鼠及Whistar大鼠腹部全厚皮片,直徑約1cm,刮除皮下脂肪,分別移植于耐受誘導(dǎo)的BALB/C小鼠側(cè)背部移植床上,待干燥后用創(chuàng)可貼包扎傷口。于皮膚移植3天后剪開創(chuàng)可貼,開始每日觀察移植物的顏色、硬度,有無結(jié)痂、脫落及鼠毛生長。如皮片變硬或結(jié)痂脫落,則判定為移植物排斥;皮片柔軟或鼠毛生長則判定為存活或耐受。 5、細(xì)胞因子水平的測定移植后第5天用酶聯(lián)免疫吸附法(ELI

6、SA)測定A組與B組血清TNF-α,INF-γ與IL-4濃度。第14天取A組與B組的脾細(xì)胞,4×105個(gè)/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中,加入用絲裂霉素滅活的異種抗原Whistar大鼠脾細(xì)胞2×105個(gè)/孔,于37℃、濕化的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后收集上清液,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測TNF-α產(chǎn)量,48小時(shí)后收集上清液,測INF-γ與IL-4量。 6、嵌合體的測定取移植后小鼠外周血50μl,加入FITC標(biāo)記的抗大鼠MHC-CL

7、ASSⅠ單克隆抗體(1μg/106細(xì)胞),避光,4℃下標(biāo)記30分鐘。用紅細(xì)胞裂解液去掉紅細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次,上流式細(xì)胞儀(FACScan;BectonDickinson)檢測移植小鼠外周血中大鼠源性細(xì)胞嵌合情況。 7、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR):檢測A、B組小鼠對特異供體及無關(guān)供者的反應(yīng)性。分別取A、B組小鼠與正常BALB/C小鼠的脾細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞,以正常SD大鼠與Whistar大鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞,做混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

8、(MLR),于96孔培養(yǎng)板每孔加反應(yīng)細(xì)胞100μl(4×105個(gè))和刺激細(xì)胞50μl(2×105個(gè)),設(shè)自體反應(yīng)孔,每組3復(fù)孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時(shí),終止培養(yǎng)前18小時(shí),每孔加入1μCi3H-TdR(中國原子能研究所),自動液閃計(jì)數(shù)器(Beckman,USA)測定,結(jié)果用cpm±SD表示。 結(jié)果:1、反向骨髓移植減輕GVHD:A組小鼠從移植后第4天開始出現(xiàn)弓背體位、體重下降、精神萎靡、活動度差、腹瀉、毛臟亂、皮

9、膚潰瘍等典型GVHD表現(xiàn),第5天開始死亡并持續(xù)下去,至第60天累計(jì)存活率為50%(4/8),GVHD發(fā)生率為100%,其中50%為重度(評分>5分)。B組小鼠除第8天死亡1只外均存活至60天,第60天累計(jì)存活率為87.5%(7/8),GVHD發(fā)生率50%,均為輕~中度(評分<5分)。C組10天內(nèi)均死于骨髓衰竭,證明此預(yù)處理方案是致死性的。與A組比較,B組GVHD的發(fā)生率及嚴(yán)重度降低,生存期明顯延長,而D組與A組比較無顯著性差異(P>0.

10、05),證明反向移植減輕GVHD的影響是供者特異性的. 2、反向骨髓移植可降低TNF-α與IFN-γ,升高IL-4:BMT后14天,B組脾細(xì)胞在異基因抗原刺激后產(chǎn)生的IL-4較A組高,同時(shí)IFN-γ與TNF-α產(chǎn)量顯著下降(P<0.001)。BMT后第5天(GVHD死亡高峰期)測血清細(xì)胞因子濃度:B組血清IFN-γ,TNF-α水平明顯低于A組,而IL-4升高,與上述體外培養(yǎng)的結(jié)果相符。 3、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)結(jié)果

11、:移植第30天,A組與B組小鼠脾細(xì)胞對供體SD大鼠脾細(xì)胞的單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)特異性降低(與正常BALB/c小鼠比較,P<0.001),但對無關(guān)第3者Whistar大鼠的脾細(xì)胞有強(qiáng)烈的增殖反應(yīng),證明移植誘導(dǎo)的耐受是供者特異性的。其中,B組的增殖抑制程度更大,為(4641.97±174.97)cpm,同A組相比,二者有顯著性差異(P<0.01),提示反向移植可進(jìn)一步抑制受鼠脾細(xì)胞對供者抗原的增殖。 4、病理分析:A組、D組死亡小鼠

12、病理學(xué)改變符合GVHD病理變化。表現(xiàn)為:①皮膚:基底細(xì)胞空泡變性、溶解壞死,大量淋巴細(xì)胞浸潤;②肝臟:,肝細(xì)胞呈不同程度的變性或壞死,匯管區(qū)有較廣泛淋巴細(xì)胞浸潤,③小腸:腸粘膜水腫和出血,,部分糜爛,小腸絨毛壞死脫落。黏膜下層淋巴細(xì)胞浸潤。病理改變屬于GVHDⅡ~Ⅲ級。B組小鼠病理改變明顯輕于A組D組,僅為輕度炎癥反應(yīng),為GVHDⅠ級。 5、移植皮膚存活情況:BMT后30d進(jìn)行皮膚移植,B組移植小鼠對SD大鼠皮膚移植物的存活時(shí)間

13、明顯大于A組(P<0.05),但Wistar大鼠的皮膚移植物均在2周內(nèi)排斥,與對照組(系天然BALB/C小鼠)比較無顯著性差異(P>005),表明嵌和體模型誘導(dǎo)出的組織移植耐受是供者特異性的。 6、嵌合率測定:移植后90天受者體內(nèi)大鼠MHC-Ⅰ類分子陽性細(xì)胞比例仍為23.77±4.50%,明顯高于對照組,且對供體大鼠的MLR長期保持抑制狀態(tài),供者皮膚移植物的存活時(shí)間明顯大于對照組,提示大鼠細(xì)胞能長時(shí)間以較高比例嵌合在小鼠體內(nèi),并

14、發(fā)揮正常功能.此外,我們研究了受者外周血WBC計(jì)數(shù),B組造血恢復(fù)時(shí)間明顯縮短,從第9天起WBC計(jì)數(shù)始終比A組高,顯示反向BMT促進(jìn)受者造血的重建。 結(jié)論:1、反向骨髓移植可降低GVHD發(fā)病率與嚴(yán)重度,延長移植小鼠的生存期,且影響是供者特異性的. 2、反向移植可通過減少Th1類細(xì)胞因子(如IFN-γ)產(chǎn)量,提高Th2類細(xì)胞因子(如IL-4),極化供者T細(xì)胞向Th2方向極化,并進(jìn)一步抑制受鼠脾細(xì)胞對供者抗原的增殖,從而減輕急

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