人-豬造血嵌合體的初步構(gòu)建及分子不相容性研究.pdf

1、血源不足和血液污染是長(zhǎng)期困擾臨床輸血治療的難題。由于艾滋病、肝炎等傳染性疾病的出現(xiàn)和流行，使這兩大問題越來(lái)越嚴(yán)峻，研究人血液代用品的任務(wù)也越來(lái)越緊迫，但是血液代用品尤其是紅細(xì)胞代用品的研究至今仍沒有取得顯著進(jìn)展。人/動(dòng)物造血嵌合體的構(gòu)建向制造人類血液提供了一種嶄新的思路和可行的手段。人/動(dòng)物造血嵌合體即在放射清髓或新生動(dòng)物體內(nèi)行人造血干細(xì)胞(human hematopoietic stem cell，hHSC)移植后所形成的嵌合體，人H

2、SC可以在嵌合體動(dòng)物體內(nèi)定居、增殖及分化。理論上講，嵌合體動(dòng)物將部分或全部由人HSC發(fā)揮造血功能'其部分或全部血細(xì)胞是由人HSC分化發(fā)育而來(lái)，與從人體采集的血細(xì)胞具有完全相同的基因起源、細(xì)胞表型和生物學(xué)功能，是替代人類血液的理想來(lái)源。 豬器官大小及免疫學(xué)、生理學(xué)特性與人類具有相似性，因此成為公認(rèn)的最佳異種器官來(lái)源。利用新生乳豬免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全的特性，行人造血干細(xì)胞移植可規(guī)避人/豬造血嵌合體(human-to-SWine hem

3、atopoietic chimera，human-swine HC)形成和穩(wěn)定所受到的免疫學(xué)屏障制約。但在異種移植中供者造血干細(xì)胞在受者體內(nèi)向骨髓和胸腺遷移、分化、活化等過程與供受者間細(xì)胞因子、黏附分子及其受體相互作用有關(guān)，供者干細(xì)胞表面的細(xì)胞因子、黏附分子受體是否可與受者相應(yīng)配體結(jié)合，取決于分子間有無(wú)嚴(yán)格的種屬限制性，即分子不相容性。這種不相容性可能影響人/豬造血嵌合體的形成和穩(wěn)定。本試驗(yàn)旨在用新生乳豬構(gòu)建人/豬造血嵌合體，初步研究、

4、探討人臍血HSC在體外豬造血微環(huán)境模型和嵌合體豬體內(nèi)分化過程中關(guān)鍵造血因子的分子不相容性。 本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括： 1、將小型豬骨髓、腎上腺、腎、脾、肝和骨骼肌等六種組織分別進(jìn)行原代培養(yǎng)，于不同時(shí)相點(diǎn)收集浸出液，用定量ELISA法檢測(cè)六種組織原代培養(yǎng)浸出液中豬關(guān)鍵造血因子-干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EP

5、O)的表達(dá)水平，結(jié)果表明：5h腎組織培養(yǎng)液中五種造血因子濃度均明顯高于相同時(shí)相點(diǎn)其它組織培養(yǎng)液(P<0.01)，且各時(shí)相點(diǎn)中第24h培養(yǎng)腎浸出液因子濃度為最高；故采用低溫高滲濃縮技術(shù)將培養(yǎng)24h腎組織浸出液用于制備豬關(guān)鍵造血因子復(fù)合物。 2、采集健康人、小型豬骨髓經(jīng)密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于專用培養(yǎng)基，經(jīng)貼壁分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)，將貼壁細(xì)胞層輻照后分別模擬人、豬造

6、血微環(huán)境；利用免疫磁珠分選技術(shù)(Magnetic activated cellsorting，MACS)分選人臍血CD34<'+>細(xì)胞。采用紅系半固體培養(yǎng)體系和紅系液體培養(yǎng)體系比較研究人/豬源性關(guān)鍵造血因子對(duì)人臍血CD34<'+>細(xì)胞向紅系分化的影響；采用模擬微環(huán)境體系比較研究體外人/豬造血微環(huán)境對(duì)人紅系祖細(xì)胞晚期分化的影響。紅系半固體培養(yǎng)體系結(jié)果顯示：人、豬源混合因子組CFU-E顯著低于人源因子組(P<0.01)；紅系液體培養(yǎng)體系結(jié)果

7、顯示：人源因子組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)和誘導(dǎo)分化效率均顯著高于人、豬源混合因子組(P<0.01)；結(jié)果表明人/豬源性關(guān)鍵造血因子存在分子不相容性；模擬微環(huán)境體系結(jié)果表明體外豬造血微環(huán)境在人EPO作用下對(duì)人紅系祖細(xì)胞的分化促進(jìn)作用為體外人造血微環(huán)境的80％左右，能夠提供對(duì)人紅系祖細(xì)胞向晚期分化的支持。 3、將人臍血CD34<'+>細(xì)胞(5×10<'5>/Kg)經(jīng)腹腔注射移植入新生乳豬體內(nèi)，構(gòu)建人/豬造血嵌合體，以連續(xù)腹腔注射人SCF(50n

8、g/Kg.3d)、EPO(100U/Kg.3d)和不注射人源因子為條件分為兩組，比較研究人/豬關(guān)鍵造血因子在嵌合體內(nèi)對(duì)人臍血CD34<'+>細(xì)胞向紅系分化的影響。于移植10 d，20 d，30 d，40 d，50 d，60 d后經(jīng)上腔靜脈取小型豬外周血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中人源性CD71<'+>細(xì)胞(紅系細(xì)胞)比例，以同齡正常小型豬外周血為陰性對(duì)照；同時(shí)，進(jìn)行嵌合體豬抗人種屬抗體檢測(cè)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)豬均正常生長(zhǎng)、發(fā)育，無(wú)感染、死亡。流

9、式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果為：注射因子組嵌合體豬外周血人源性CD71<'+>細(xì)胞比例明顯高于非注射組(P<0.01)，表明體內(nèi)豬源因子不能支持人臍血CD34<'+>細(xì)胞向紅系分化，人/豬源性關(guān)鍵造血因子存在分子不相容性。豬抗人種屬抗體檢測(cè)結(jié)果為：正常小型豬于16d齡出現(xiàn)針對(duì)人源性細(xì)胞的種屬抗體；而嵌合體豬則在50d齡開始出現(xiàn)，抗體效價(jià)明顯低于同齡正常豬，表明給新生乳豬移植人臍血造血干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)人/豬造血嵌合體和免疫耐受的初步形成。 臍血

10、中的造血干細(xì)胞免疫原性低且來(lái)源豐富，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的干細(xì)胞。新生乳豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善且基本能夠模擬人各種生理過程，成為較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我們的實(shí)驗(yàn)證明給新生乳豬移植人臍血造血干細(xì)胞誘導(dǎo)形成人/豬造血嵌合體和供者性免疫耐受是可行的，嵌合體豬外周血中人源紅系細(xì)胞的出現(xiàn)表明人造血干/祖細(xì)胞能夠在嵌合體內(nèi)向紅系分化和發(fā)育，初步實(shí)現(xiàn)了嵌合體供者型造血。因此，用新生乳豬可建立人/豬造血嵌合體模型，為進(jìn)行人臍血造血干細(xì)胞在嵌合體內(nèi)生物學(xué)特性