群體感應和環(huán)二鳥苷酸對銅綠假單胞菌致病因子的調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥性越來越嚴重，已成為人類生存的最大危機。我國是世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一，每年約有8萬人死于抗生素的泛濫使用，細菌耐藥問題與其它國家相比更加嚴峻，專家預言，我國有可能率先進入“后抗生素時代”，亦即抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時代。因此，如何解決細菌耐藥的難題和研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種臨床上最常見的引起嚴重獲得性感染的條件致病

2、菌，能伺機感染任何部位，如燒傷處傷口、角膜、尿道及肺部等，并引起細菌性心內(nèi)膜炎及腸胃炎。研究表明，PA生物膜(Biofilm，BF)的形成是其產(chǎn)生抗生素耐藥的主要誘因。生物膜是由細菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細胞結(jié)構(gòu)，一旦形成生物膜，細菌將具有極強的抗生素耐藥性(比浮游細菌高100-1000倍)。對細菌生物膜的研究將為新型抗生素的研發(fā)開辟新的途徑。 生物膜的形成受復雜的網(wǎng)絡調(diào)控，以往的研究闡明了群體感應(Q

3、uorumSensing，QS)和細菌的第二信使環(huán)二鳥苷酸(Cyclic Diguanylic Acid，c-di-GMP)均能調(diào)控PA的BF形成。然而，目前QS和c-di-GMP之間的關系尚不清楚。本研究擬通過構(gòu)建QS缺失突變株、c-di-GMP合成或降解酶過表達株，利用激光共聚焦、定量PCR等技術研究PA中QS和c-di-GMP信號通路之間的內(nèi)在關系。 構(gòu)建了PAO1群體感應單缺失菌株JP1(ΔlasI)、PDO100(Δr

4、hlI)和雙缺失菌株MW(ΔlasIΔrhlI)，通過對群體感應單缺失和雙缺失菌株在運動能力、致病因子的產(chǎn)生和生物膜形成能力的比較，表明Rhl-QS系統(tǒng)對菌株影響最為明顯，Rhl-QS缺失以后，菌株的運動能力降低，不能產(chǎn)生鼠李糖酯和綠膿菌素等致病因子。利用靜態(tài)和動態(tài)兩種模型評價了群體感應對生物膜的影響，結(jié)果顯示在靜態(tài)條件下群體感應缺失有利于生物膜形成，但是在動態(tài)模型下群體感應缺失生物膜形成減少。測定了野生型和群體感應缺失菌株對氨基糖苷類

5、抗生素阿米卡星的敏感性，結(jié)果表明，生物膜形成后菌株的抗生素耐藥性比浮游狀態(tài)提高了約黏附器官的變化，結(jié)果表明c-di-GMP增加后細胞表面的疏水性降低，多糖合成酶基因pelA和pelD的轉(zhuǎn)錄上調(diào)；原子力顯微鏡和投射電鏡結(jié)果未觀察到群體感應缺失和環(huán)二鳥苷酸改變對細菌表面運動器官的影響。 綜上所述，在銅綠假單胞菌中環(huán)二鳥苷酸和群體感應兩條信號通路并不是完全孤立的，環(huán)二鳥苷酸能調(diào)控Rhl-QS群體感應系統(tǒng)，但是其對生物膜的影響并不完全依