輕型鏈球菌促進銅綠假單胞菌致病性及機制研究.pdf

1、第一部分輕型鏈球菌對銅綠假單胞菌BF致病性的影響
　　目的：機械通氣廣泛應(yīng)用及生物膜（BF）在氣管導(dǎo)管（ETT）的形成，新生兒呼吸機相關(guān)肺炎（VAP）仍然是臨床上的棘手問題。我們前期發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)和輕型鏈球菌(S. mitis)，一種口咽部正常細(xì)菌，在新生兒ETT表面最常見；且S. mitis檢出率在VAP組患兒中較高。鑒于BF內(nèi)的不同種細(xì)菌可能促進或抑制對方，本研究目的在于探討S. mitis能否

2、影響P. aeruginosa的致病性。
　　方法:將BF培養(yǎng)分為PAO1組、S. mitis組和PAO1+S. mitis組，并收集生物膜培養(yǎng)液（BCM）。結(jié)晶紫、平板計數(shù)以及光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌粘附能力。結(jié)晶紫、平板計數(shù)、CCK-8及激光共聚焦（CLSM）觀察BF形成。BCM刺激人氣道上皮細(xì)胞（BEAS-2B）后，檢測細(xì)胞活性、IL-8表達以及TLR2、4的表達。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示S.mitis幾乎不能粘附于非生物介質(zhì)表

3、面，且不能形成BF，但它增強了PAO1的粘附能力和BF形成(P<0.05)?；旌螧F內(nèi)總活菌數(shù)和活P. aeruginosa數(shù)明顯高于PAO1單獨組(P<0.05)。然而，與PAO1單獨組BCM相比較，混合BCM的細(xì)胞毒性及其誘導(dǎo)的IL-8，TLR2、4表達明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:S. mitis作為傳統(tǒng)觀點認(rèn)為的口咽部正常細(xì)菌，一方面它能增強PAO1粘附力及BF形成，從而逃避宿主免疫及抗生素殺傷；另一方面S.mit

4、is減輕了PAO1誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)。可能是新生VAP患兒ETT BF表面S. mitis檢出率高的原因。研究結(jié)果提示我們不能忽視傳統(tǒng)觀點認(rèn)為的非致病菌在BF中的作用。對于新生兒VAP ETT表面BF致病機制提供了新的思路，該觀點亦可能為其他BF相關(guān)感染提供新研究方向。
　　第二部分輕型鏈球菌對浮游銅綠假單胞菌致病性的影響
　　目的：第一部分已證實S. mitis能增強PAO1粘附力、BF形成能力，并減輕PAO1 BCM誘導(dǎo)

5、的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)。BF成熟后亦可釋放浮游細(xì)菌，對宿主產(chǎn)生影響。且研究表明某些口腔常駐菌群（如牙卟啉單胞菌、放線菌等）能促進某些呼吸道病原體對于宿主細(xì)胞及組織的粘附等，從而影響其致病性。那么S.mitis對于浮游狀態(tài)的P.aeruginosa有無作用呢？這是本部分實驗擬闡明的問題。
　　方法：將浮游菌分組為PAO1組、S.mitis組和PAO1+S.mitis組。將細(xì)菌（MOI=100）加入人呼吸道上皮細(xì)胞（BEAS-2B）。侵

6、襲實驗和粘附實驗觀察細(xì)菌對BEAS-2B細(xì)胞的侵襲和粘附力。CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，ELISA法檢測細(xì)胞IL-8表達。
　　結(jié)果：與PAO1單獨組相比較，S.mitis可促進PAO1對BEAS-2B的侵襲能力(P<0.05)，而對PAO1粘附BEAS-2B的能力無明顯影響(P>0.05)。PAO1+S.mitis組與PAO1單獨組在細(xì)胞存活率及IL-8水平無顯著差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：S.mitis能增強PAO

7、1對BEAS-2B細(xì)胞侵襲性，但對PAO1粘附BEAS-2B細(xì)胞無影響，提示兩者機制不同。雖然在S. mitis存在下，浮游PAO1侵襲性增強，但細(xì)胞存活率及炎癥無顯著影響，這可能利于PAO1在宿主細(xì)胞內(nèi)形成BF，逃逸宿主免疫。S. mitis對PAO1致病性的影響可能主要在其BF狀態(tài)產(chǎn)生。
　　第三部分輕型鏈球菌通過增強銅綠假單胞菌生物膜QS系統(tǒng)促進其生物膜形成
　　目的：多菌種BF內(nèi)部菌群間交流調(diào)控機制是BF形成的關(guān)鍵環(huán)

8、節(jié)，其中密度感應(yīng)(Quorum sensing, QS)系統(tǒng)是研究多菌種BF調(diào)控的關(guān)鍵。第一部分已證實S. mitis能增強PAO1粘附力、BF形成能力，但具體機制不明；而P.aeruginosa的QS系統(tǒng)與其粘附力、BF形成能力密切相關(guān)。那么，S.mitis對P.aeruginosa上述能力的促進作用是否與其作用于P. aeruginosa的QS系統(tǒng)相關(guān)呢？
　　方法：BF分為PAO1組、P.aΔlasR組、P.aΔLasRΔr

9、hlR組、S. mitis組、PAO1+S. mitis組、P.aΔlasR+S. mitis組、P.aΔLasRΔrhlR+S. mitis組。結(jié)晶紫、平板計數(shù)法以及光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌粘附能力。結(jié)晶紫、平板計數(shù)及激光共聚焦（CLSM）觀察BF形成。qPCR法檢測各組BF的QS基因表達（包括lasI、lasR、rhlI、rhlR）。
　　結(jié)果：PAO1+S.mitis、P.aΔlasR+S. mitis、P.aΔLasRΔrhlR

10、+S. mitis三個組的粘附力均分別明顯強于單獨 PAO1、P.aΔlasR和 P.aΔLasRΔrhlR組(P<0.05)；且平板計數(shù)法結(jié)果顯示PAO1+S.mitis、P.aΔlasR+S.mitis、P.aΔLasRΔrhlR+S. mitis混合組中粘附的P. aeruginosa菌分別較單獨PAO1、P.aΔlasR、P.aΔlasRΔrhlR組多(P<0.05)。PAO1+S. mitis混合組的BF生物量明顯多于PAO1

11、單獨組(P<0.05)；然而，P.aΔlasR+S. mitis組和P.aΔLasRΔrhlR+S. mitis組BF生物量與P.aΔlasR組、P.aΔLasRΔrhlR組BF生物量無明顯差異(P>0.05)。S.mitis能上調(diào)PAO1菌株的QS基因表達（包括lasI、lasR、rhlI、rhlR），明顯高于單獨 PAO1組的表達(P<0.05)；然而 P.aΔlasR+S.mitis組和P.aΔLasRΔrhlR+S. mitis

12、組的QS基因表達（包括lasI、lasR、rhlI、rhlR）并無上調(diào)，與單獨P.aΔlasR和P.aΔlasRΔrhlR組無差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：S.mitis對于P.aeruginosa粘附力的促進不依賴于QS系統(tǒng)，有其他機制參與。S. mitis通過上調(diào)P.aeruginosa QS基因促進其BF形成。這種促進機制是通過S.mitis直接作用還是其分泌某些物質(zhì)（如AI-2）對P. aeruginosa BF形成起