MicroRNAs在冠心病血瘀證中的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:MicroRNAs(miRNAs)具有調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡的功能，與心血管疾病密切相關(guān)。本研究使用TaqMan低密度芯片(TLDA)從冠心病血瘀證24h大鼠模型心臟組織中篩選差異表達(dá)的miRNAs，采用生物信息學(xué)分析的手段對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建miRNAs與Gene、Ontology(GO)、Pathway間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凋亡通路僅被microRNA-384-5p(miR-384-5

2、p)調(diào)控。因此，本研究旨在確定miR-384-5p在大鼠冠心病血瘀證中的作用及機(jī)制。
　　 方法:1.構(gòu)建冠心病血瘀證24h大鼠模型，通過基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)的miRNAs;2.采用生物信息學(xué)分析的手段，對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行Gene、GO、Pathway等生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建miRNA-Gene-network、miRNA-GO-network、miRNA-Pathway-network及Pathway-Path

3、way-network;3.采用qRT-PCR手段對(duì)凋亡通路相關(guān)的具有顯著意義的靶基因(PIK3 CD，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1，CASP3及IL1A)進(jìn)行驗(yàn)證;4.構(gòu)建過表達(dá)miR-384-5p及miR-384-5p抑制劑的H9c2細(xì)胞模型，通過MTT、Western Blot等技術(shù)在細(xì)胞水平上確定miR-384-5p對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡的影響;5.通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析確定miR-384-5p的靶基因;6.構(gòu)建過表

4、達(dá)miR-384-5p及miR-384-5p抑制劑的H9c2細(xì)胞模型，通過Western Blot技術(shù)在細(xì)胞水平上確定miR-384-5p對(duì)其靶基因的影響。
　　 結(jié)果:1.基因芯片篩選結(jié)果顯示，冠心病血瘀證大鼠的心臟組織中16個(gè)miRNAs的表達(dá)有顯著性變化，其中12個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào);2.生物信息學(xué)手段構(gòu)建了miRNA-Gene-network、miRNA-GO-network、miRNA-Pathway-network及Pa

5、thway-Pathway-network;3.qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了PIK3CD，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1, CASP3及IL1A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PIK3CD，PPP3CA，PPP3R1，CASP3及ILlA的表達(dá)均顯著上調(diào)，與信息分析結(jié)果相符合，PIK3CB表達(dá)下調(diào)，其信息分析結(jié)果為假陽性;4.MiR-384-5p可以上調(diào)H9c2細(xì)胞cleaved caspase3的表達(dá)，相反miR-384-5p抑制劑可以下調(diào)其表達(dá)

6、，揭示了miR-384-5p可以調(diào)節(jié)凋亡通路;5.MiR-384-5p抑制H9c2細(xì)胞活力，而miR-384-5p抑制劑可以促進(jìn)H9c2細(xì)胞活力，說明miR-384-5p的表達(dá)下調(diào)可以提高H9c2細(xì)胞活力;6.MiR-384-5p抑制劑促使H9c2細(xì)胞PIK3CD蛋白表達(dá)顯著上調(diào);7.無論是在模型大鼠心臟組織還是缺氧的H9c2細(xì)胞中，miR-384-5p的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，并且PIK3CD蛋白的表達(dá)水平均顯著上調(diào);8.雙熒光素酶報(bào)告基