卡托普利對高氧致CLD新生大鼠肺組織纖維化保護作用及機制探討.pdf

1、慢性肺疾病(Chroniclungdisease，CLD)是早產(chǎn)兒在肺發(fā)育未成熟的基礎(chǔ)上，因感染、容量或氣壓傷、高氧等引起的肺部遠期合并癥。CLD發(fā)生機制的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點之一，大量臨床和動物實驗認為反應性氧/氮自由基衍生物在CLD肺損傷過程中起重要作用，氧/氮自由基可直接或通過脂質(zhì)過氧化反應損傷細胞成分，使蛋白質(zhì)-巰基氧化并可造成DNA斷裂，損傷肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞，使肺泡毛細血管通透性增高，加重滲出；此外，氧中毒

2、更嚴重的后果是引發(fā)一系列炎癥反應。研究顯示，炎性損傷是發(fā)生CLD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這些炎性介質(zhì)具有廣泛的生物活性，如引起炎性介質(zhì)的再釋放、細胞趨化作用、毛細血管通透性增加、肺血管收縮、刺激成纖維細胞增殖和分泌纖維蛋白，最終形成肺纖維化。炎癥和氧自由基產(chǎn)物均可以誘導細胞凋亡，凋亡也可能在肺組織急性損傷后的修復與重建中起重要作用。這些研究雖從氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等諸多角度闡明了CLD的發(fā)生和發(fā)展過程，但其中的確切機制不詳。 目前研

3、究認為成纖維細胞是肺纖維化過程的重要成分，能夠合成細胞外基質(zhì)和細胞因子，啟動炎癥反應，且調(diào)節(jié)Ⅱ型肺泡上皮細胞和其他一些細胞的功能。肺成纖維細胞在各種環(huán)境因素刺激下增殖進而分泌過量的纖維蛋白，最終形成肺纖維化。 近年來，隨著組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-AngiotesinSystem，RAS)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)催化產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有促進細胞增生，細胞外基質(zhì)生成的作用。體外研究表

4、明AngⅡ刺激肺成纖維細胞，可促使成纖維細胞的DNA合成表達增強、促進成纖維細胞的增殖，分泌更多的膠原成分從而導致肺組織纖維化。而卡托普利是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，臨床上主要用于治療高血壓和充血性心力衰竭。對卡托普利的深入研究表明，卡托普利可清除多種自由基，表現(xiàn)出較強的抗氧化作用，可降低血管的通透性，減輕炎性滲出和組織水腫，具有一定的抗炎、抗纖維化作用。由于這些新功能的認識，臨床上對卡托普利的新用途產(chǎn)生了濃厚的興趣。 本實驗以足

5、月新生Wistar大鼠生后即持續(xù)吸入高濃度氧(FiO2：0.9)14d、21d造成高氧肺損傷模型，同時給予卡托普利灌胃治療，通過檢測肺組織ACE、AngⅡ、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(ColⅢ)、細胞間黏附分子(ICAM-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)含量及mRNA表達，并同步觀察肺組織形態(tài)學的變化，探討高氧致CLD新生大鼠肺組織RAS的動態(tài)變化及卡托普利的保護作用，以進一步研究高氧致新生大鼠CLD的發(fā)病機制，為新生兒臨床

6、用藥提供資料。 實驗材料與方法：一、動物模型高氧組、鹽水對照組和卡托普利治療組將足月新生Wistar大鼠(連同母鼠)生后即置于有機玻璃氧艙內(nèi)持續(xù)吸入高濃度氧(FiO2：0.9用測氧儀監(jiān)測)14d、21d造成高氧肺損傷模型，CO2濃度＜0.5％(用鈉石灰吸收CO2)，溫度23℃-25℃，濕度50％-70％，每天定時開箱1h添加水、飼料及更換墊料，并與空氣對照組交換代母鼠以避免因氧中毒而導致喂養(yǎng)能力下降?？諝鈱φ战M吸入空氣，具體方法

7、及實驗因素同高氧組；卡托普利治療組于生后7d每天經(jīng)胃管灌服卡托普利20-40mg/kg/d(用生理鹽水配成5.4mg/ml混懸液)，鹽水對照組每天經(jīng)胃管灌服等量生理鹽水。 二、標本采集和處理每組分別于實驗開始后的第1、3、7、14、21d隨機選取6只，腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg麻醉后處死。將左肺組織置于4％多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4μm切片，蘇木素-伊紅染色后觀察肺組織形態(tài)變化。取下右肺組織，用冷生理鹽水

8、洗凈殘血，吸干水分，置于無Rnase的Eppendorf管中，-80℃冷凍保存待測。 三、實驗方法：(一)動態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)和死亡情況、檢測體重，使用壽命表法估計各組新生大鼠的生存率，并比較時點生存率和生存曲線。 (二)病理形態(tài)學研究光鏡觀察：切片進行常規(guī)HE染色，光鏡下動態(tài)觀察各組新生大鼠肺組織的病理改變。 (三)肺組織ACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1含量及mRNA表

9、達的動態(tài)變化 1.用日產(chǎn)7170全自動生化分析儀測定ACE的活性(活性單位)。 2.放免法檢測肺組織AngⅡ濃度。3.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)動態(tài)檢測肺組織ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1的含量變化。 4.免疫組織化學技術(shù)(SABC)法檢測肺組織ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白的表達。 5.RT-PCR技術(shù)檢測肺組織ACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1mR

10、NA的動態(tài)表達。 四、統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差(-x±s)表示。差異比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行Dunnettt檢驗及制作統(tǒng)計圖。時點生存率的比較用u檢驗，生存曲線的比較用對數(shù)秩檢驗。 結(jié)果：一、高氧及卡托普利治療對新生大鼠生存率和一般狀態(tài)的影響(一)各組新生大鼠存活情況：隨著高氧暴露時間的延長新生大鼠死亡明顯增多，生存率逐漸下降，在高氧暴露3d開始，高氧組生存率降低(p＜0.05)，3d起新生大鼠在高

11、氧暴露和空氣中的生存率曲線不同(p＜0.01)，高氧組明顯降低?？ㄍ衅绽委熃M生存率增高，鹽水組同高氧組，而空氣組均無死亡。 (二)各組新生大鼠體重變化：高氧組在高氧暴露7d開始，新生大鼠體重與空氣對照組相比下降(p＜0.05)，隨著高氧暴露時間的延長，體重差異逐漸明顯(p＜0.01)，卡托普利治療組體重略增高，鹽水組同高氧組。 (三)各組新生大鼠一般狀態(tài)的變化：高氧組新生大鼠一般在7-10d后開始出現(xiàn)活動能力下降，呼吸

12、急促和不同程度發(fā)紺，隨著高氧暴露時間的延長而逐漸加重，14-21d后出現(xiàn)對氧的依賴。卡托普利治療組對離氧的耐受能力好于高氧組。而空氣組則無以上異常表現(xiàn)。 二、各組新生大鼠肺組織病理形態(tài)學變化肺組織的病理改變：空氣組：第1d表現(xiàn)為肺泡腔略大，肺泡間隔稍厚，第3-21d肺泡腔大小基本一致，肺泡間隔變?。桓哐踅M及鹽水組：第1d同空氣對照組，第3-7d肺泡壁毛細血管擴張，肺間隔水腫，肺間隔及肺泡腔內(nèi)有中性粒細胞浸潤，第14d部分肺泡腔變

13、狹長，肺間隔增寬，肺間質(zhì)細胞增多，出現(xiàn)肺組織纖維化改變。第21d正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，殘留肺泡直徑明顯縮小，肺組織出現(xiàn)嚴重的纖維化?？ㄍ衅绽委熃M肺組織纖維化病變明顯減輕。 三、肺組織RAS、ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量及mRNA表達的動態(tài)變化 各組肺組織ACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量及mRNA表達在實驗后第1、3、7d比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；

14、高氧組及鹽水對照組第14d明顯升高，第21d達高峰(p＜0.05，或p＜0.01)?？ㄍ衅绽委熃MACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量及mRNA表達明顯低于高氧組及鹽水對照組(p＜0.05，或p＜0.01)，但仍高于空氣對照組(p＜0.05)。 四、肺組織內(nèi)ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白表達部位及強度的動態(tài)變化 空氣對照組ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β

15、1蛋白僅在氣管壁或血管壁及其周圍的結(jié)締組織有微弱表達，高氧組及鹽水對照組1d、3d、7d表達部位同上，14d時陽性表達細胞增加，主要在肺間質(zhì)和肺泡壁，表達強度高于空氣對照組(p＜0.05)，21d可見大量肺間質(zhì)細胞表達，表達強度明顯高于空氣對照組(p＜0.01)；卡托普利治療組ColⅠ、ColⅢ、ICAM-1、TGF-β1蛋白表達強度明顯低于高氧組及鹽水對照組(p＜0.05，或p＜0.01)，但仍高于空氣對照組(p＜0.05)。

16、 結(jié)論：1.高氧暴露后的新生大鼠，表現(xiàn)出肺泡發(fā)育障礙和纖維組織增生的病理形態(tài)學特點，符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特點和解剖學改變。 2.肺組織存在RAS，持續(xù)高氧暴露14d、21d后的新生大鼠肺組織ACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ蛋白含量及mRNA表達明顯高于空氣對照組，同時肺組織出現(xiàn)嚴重的纖維化。ACE、AngⅡ、ColⅠ、ColⅢ蛋白含量及mRNA表達時間的先后性及定位一致性提示RAS參與了高氧肺損傷、肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

17、 3.持續(xù)高氧暴露14d、21d后的新生大鼠肺組織ICAM-1、TGF-β1蛋白含量及mRNA表達明顯高于空氣對照組，同時肺組織出現(xiàn)嚴重的纖維化。ICAM-1、TGF-β1蛋白含量及mRNA表達的變化程度與肺組織形態(tài)學改變時間相一致，提示ICAM-1、TGF-β1參與了高氧肺損傷、肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。 4.應用卡托普利進行干預治療后，卡托普利治療組與持續(xù)高氧暴露后的高氧組及鹽水組比較肺組織ACE、AngⅡ、ColⅠ、Co