洛沙坦對(duì)高氧致CLD新生大鼠肺纖維化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究將新生鼠暴露于85％高氧環(huán)境發(fā)病中，制造CLD的動(dòng)物模型，同時(shí)給特異性AT1R拮抗劑losartan干預(yù)，通過組織病理、形態(tài)學(xué)分析并且進(jìn)一步從蛋白、基因水平等方法進(jìn)行檢測(cè)，從肺局部RAS的受體水平來研究在高氧致新生大鼠CLD發(fā)病機(jī)制，探討losartan抗肺纖維化可能的作用機(jī)制，為尋求早產(chǎn)兒CLD的治療提供新思路。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、動(dòng)物模型本實(shí)驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。足月新生Wistar大

2、鼠(連同母鼠)被隨機(jī)分為4組：AIR組、空氣對(duì)照組；O<,2>組、單純高氧暴露組；AO<,2>組、高氧+注射用水組；LO<,2>組、高氧+losartan組。將2-4組在生后24 h內(nèi)置于玻璃氧艙中，持續(xù)輸入氧氣，維持在FiO<,2>0.85，每日兩次監(jiān)測(cè)氧濃度(美國(guó)OM-25ME型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè))，用鈣石灰吸收CO<,2>，使其濃度小于0.5％(美國(guó)Dapex氣體分析儀)，溫度20℃～25℃，濕度50％～70％，每天開箱0.5h，稱重，添

3、加水及飼料，更換墊料，與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護(hù)理能力降低；空氣對(duì)照組置于空氣中(FiO<,2> 0.21)，飼養(yǎng)條件與高氧組相同。3、4組于生后6d每天分別經(jīng)胃管灌服注射用水(3ml/kg)、losartan(5mg/kg/d，注射用水3ml/kg配成混懸液)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 二、標(biāo)本采集和處理每組分別于實(shí)驗(yàn)開始后的第1、3、7、14、21天分別從中隨機(jī)抽取8只，腹腔注射5％水合氯醛6ml/kg麻醉后處死。立即打

4、開胸腔，無菌條件下分離肺組織，取右肺各葉置于無Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛(0.1MPBS，pH7.0～7.6)固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。 三、實(shí)驗(yàn)方法： (一)、一般狀況觀察動(dòng)態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)和死亡情況、監(jiān)測(cè)體重，并比較時(shí)點(diǎn)生存率和生存曲線。 (二)、病理形態(tài)學(xué)研究1、光鏡觀察：切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變。

5、 2、肺泡間隔厚度測(cè)定： 3、Masson三聯(lián)染色動(dòng)態(tài)觀察肺組織內(nèi)的膠原纖維沉積。 (三)、采用免疫組化、RT-PCR檢測(cè)肺組織AT1R的表達(dá) (四)、各組膠原蛋白含量和基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 1、免疫組化方法檢測(cè)肺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在肺組織中表達(dá)的強(qiáng)度和部位。 2、酸解法檢測(cè)肺組織羥脯氨酸的含量，間接反映肺組織膠原的含量。 3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELIsA)動(dòng)態(tài)檢測(cè)肺

6、組織Ⅰ型膠原蛋白(ColI)的含量變化。 4、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織ColI mRNA的表達(dá)。 (五)、采用免疫組化、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織MMP-13和TIMP-1表達(dá)的變化四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SSPS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較采用方差分析(F檢驗(yàn))。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent t test。相關(guān)性分析；生存率的估計(jì)使用壽命表法，時(shí)點(diǎn)生存率的比較

7、用u檢驗(yàn)。結(jié)果以P<0.05有意義。 結(jié)論： 1、新生大鼠持續(xù)高濃度氧氣暴露，可導(dǎo)致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學(xué)改變，符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)和解剖學(xué)改變。 2、新生大鼠肺組織AT1R主要定位在肺泡上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞、支氣管和毛細(xì)血管外膜；高氧組在內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)陽性染色。ATlR在高氧后期表達(dá)明顯增強(qiáng)，與肺纖維化發(fā)生時(shí)間一致性的結(jié)果提示AnglI作為

8、AT1R配體可能參與高氧CLD的發(fā)生。 3、在高氧暴露的中晚期，在肺泡腔的表面及間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)彌漫性、條索狀α-SMA．表達(dá)，而在空氣對(duì)照組α-SMA在次級(jí)隔的頂端呈點(diǎn)狀表達(dá)，而在肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)卻罕見表達(dá)。推測(cè)持續(xù)高濃度氧氣暴露誘發(fā)肺組織MFB表達(dá)部位及表達(dá)的強(qiáng)度的改變可能是CLD發(fā)生的主要原因之一。 4、Losartan可明顯降低高氧致CLD新生大鼠肺組織α-SMA、Col蛋白和mRNA的表達(dá)，降低肺組織HYP的含量；α-

9、SMA與ColI mRNA表達(dá)具有顯著相關(guān)性結(jié)果，提示Losartan可能通過抑制肺組織MFB的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制ColI mRNA的表達(dá)來減輕高氧CLD新生大鼠肺纖維化。結(jié)果同時(shí)暗示高氧致新生大鼠肺組織纖維化的發(fā)生可能通過Ang Ⅱ與AT1R結(jié)合，調(diào)節(jié)ColI合成來介導(dǎo)完成的。 5、MMP-13和TIMP-1在正常肺組織有表達(dá)，提示MMP-13和TIMP-1可能在參與肺的形態(tài)構(gòu)建，膠原代謝等過程。 6、在高氧晚期肺組織m

10、mp-13基因和蛋白表達(dá)顯著下降；而TIMP-1表達(dá)明顯增強(qiáng)。猜測(cè)在高氧暴露晚期MMP-13/TIMP-1mRNA和蛋白表達(dá)失衡導(dǎo)致膠原降解減弱，這可能是高氧后期以ColI為代表的肺組織ECM異常沉積的關(guān)鍵所在。 7、Losartan可顯著誘導(dǎo)高氧肺組織MMP-13mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá)，使得MMP-13/TIMP-1比值得到部分糾正，減少高氧肺組織中ColI的異常沉積。提示：肺局部AngⅡ可能