自體骨骼肌細(xì)胞尿道周圍注射治療壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、壓力性尿失禁同勃起功能障礙一樣，是一種多發(fā)、難以啟齒，且嚴(yán)重影響患者身心健康的疾病，多發(fā)生于生育后女性和前列腺術(shù)后，尋求一種簡(jiǎn)便、安全、有效的治療方法十分重要。除了手術(shù)，尿道周圍注射是目前運(yùn)用較多、效果較好的方法，常用的注射材料有特氟隆、膠原、硅有機(jī)樹脂(硅微粒和硅微球)、生物玻璃等。但這些材料注射治療遠(yuǎn)期效果較差，且有過敏、炎癥、注射顆粒遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥。近年來，人們開始尋找更為有效的注射材料治療尿失禁。人們?cè)趯?duì)Duchenne氏肌營(yíng)

2、養(yǎng)不良(DMD)的研究過程中，對(duì)骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為有了進(jìn)一步的了解。骨骼肌包括有絲分裂后一些很長(zhǎng)的被稱為肌纖維(肌原纖維)的多核細(xì)胞和單核成肌細(xì)胞(myoblast)。成肌細(xì)胞在通常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，肌肉損傷時(shí)能夠分裂，然后和肌原纖維融合以修復(fù)肌肉的損傷。最近Qu等又純化出一種分裂能力很強(qiáng)的肌細(xì)胞叫肌源細(xì)胞(musclederivedcells，MDC)，它含有衛(wèi)星細(xì)胞(musclesatellitecells)，后者具有干細(xì)胞功

3、能，在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為骨骼肌纖維、平滑肌纖維、甚至軟骨細(xì)胞。且分化后的肌纖維為有絲分裂后的成纖維細(xì)胞(postmitoticwithmaturation)，不會(huì)無限制分裂而失控。隨著泌尿系統(tǒng)組織工程技術(shù)的發(fā)展，人們開始注意到自體MDC移植對(duì)改善尿道括約肌和膀胱的功能或許有幫助。而且下尿路功能障礙，尤其是尿失禁，病變部位局限，位置表淺，易于注射。而且自身組織材料，和其他注射材料相比，不存在組織相容性問題，亦不怕注射物遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

4、 本研究以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)大鼠，尤其是成年大鼠的MDC進(jìn)行純化、培養(yǎng)及鑒定；攜帶Lac-2基因的腺病毒轉(zhuǎn)染肌源細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后MDC的自體尿道周圍注射；壓力性尿失禁模型的制備；MDC自體尿道周圍注射對(duì)尿失禁的治療作用等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。并取得了以下結(jié)果：(1)建立了成年大鼠MDC純化、培養(yǎng)及鑒定方法；(2)MDC自體尿道周圍注射可長(zhǎng)期存活；(3)模擬婦女難產(chǎn)成功建立了大鼠壓力性尿失禁模型；(4)MDC自體尿道周圍注射對(duì)壓力性尿失禁有治療作用

5、。這些為MDC自體尿道周圍注射將來在臨床上的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分成年大鼠骨骼肌肌源細(xì)胞的純化、培養(yǎng)及鑒定 目的：建立一種成年大鼠骨骼肌肌源細(xì)胞的純化及培養(yǎng)方法。 方法：取成年雌性SD大鼠前肢肱三頭肌，用膠原酶和dispase進(jìn)行消化，200目的篩網(wǎng)濾過。采用差速貼壁的方法純化骨骼肌肌源細(xì)胞：將細(xì)胞懸液置入經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以細(xì)胞貼壁的快慢將肌源細(xì)胞分為PP1-PP6。在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1小時(shí)，貼

6、壁的細(xì)胞為PP1；未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2小時(shí)貼壁的細(xì)胞為PP2；未貼壁的細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18小時(shí)，貼壁的細(xì)胞為PP3,未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)，貼壁的細(xì)胞為PP4，此過程重復(fù)(間隔24小時(shí))至PP6。用含20％胎牛血清的HamsF10培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcometricactin)免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)PP1-PP6的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：PP1、PP2細(xì)胞

7、貼壁迅速，細(xì)胞形態(tài)呈扁平、多突起，且胞漿極其豐富，細(xì)胞數(shù)量多，生長(zhǎng)迅速，PP3以后的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，貼壁緩慢，早期細(xì)胞呈梭形或紡錘形。經(jīng)α-sarcometricactin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，骨骼肌肌源細(xì)胞呈陽性，而成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均為陰性。PP1、PP2陽性率低，PP3-PP6陽性率逐漸增高，肌管為強(qiáng)陽性。 結(jié)論：采用差速貼壁的方法可以成功分離、純化成年鼠骨骼肌肌源細(xì)胞，為將來自體肌肌源細(xì)胞注射治療壓力性尿失禁打下了基礎(chǔ)

8、。 第二部分:鼠肌源細(xì)胞自體及異體移植的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討肌源細(xì)胞(musclederivedcell，MDC)自體及異體移植能否在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，以及在肌源性疾病治療，尤其是在壓力性尿失禁治療中的價(jià)值。方法：采用差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)6只雌性SD大鼠的MDC，然后用攜帶Lac-Z基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染MDC，待轉(zhuǎn)染成功后將約5×106攜帶Lac-Z基因的MDC注射于自體(6只)和同種異體(4只)大鼠膀胱頸周圍。自體注射

9、后7和15天，異體注射后1和3天處死大鼠取出膀胱及后尿道，注射部位組織行組織學(xué)檢查及X-gal染色。 結(jié)果：自體移植后在各時(shí)間點(diǎn)注射部位未見明顯炎癥改變及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部細(xì)胞層數(shù)增多。經(jīng)X-gal染色顯示在7天及15天均可見大量的細(xì)胞被藍(lán)染，提示移植細(xì)胞在體內(nèi)成活。異體細(xì)胞移植后檢查：組織學(xué)檢查同自體移植，X-gal染色顯示在第1天可見少許細(xì)胞被藍(lán)染，第3天僅在個(gè)別視野有零星被藍(lán)染的細(xì)胞。 結(jié)論：自體MDC移植在體內(nèi)可

10、獲長(zhǎng)期存活，有可能成為治療肌源性疾病(如壓力性尿失禁、心肌梗死等)的有效方法，而異體注射在體內(nèi)不能長(zhǎng)期存活。 第三部分:模擬婦女難產(chǎn)建立大鼠壓力性尿失禁模型 目的：模擬婦女難產(chǎn)建立大鼠壓力性尿失禁模型，并對(duì)陰道長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)張對(duì)漏尿點(diǎn)壓及尿道解剖的影響進(jìn)行了研究。 方法：26只成年未生產(chǎn)過的雌性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(22只)和對(duì)照組(4只)，實(shí)驗(yàn)組陰道內(nèi)置水囊擴(kuò)張4h模擬難產(chǎn)。4周后，兩組均行尿流動(dòng)力學(xué)檢查測(cè)膀胱最大

11、容量和漏尿點(diǎn)壓(LPP)及噴嚏實(shí)驗(yàn)，然后，處死所有大鼠取膀胱及尿道行組織學(xué)檢查。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組膀胱最大容量及LPP均較對(duì)照組明顯降低，噴嚏實(shí)驗(yàn)有45.5％的出現(xiàn)壓力性尿失禁(SUI)，而對(duì)照組無一例出現(xiàn)SUI。組織學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)組見尿道周圍骨骼肌及平滑肌肌層斷列、變薄，膠原組織明顯增加，對(duì)照組無明顯改變。結(jié)論：陰道長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)張可導(dǎo)致SUI，是研究SUI形成機(jī)制及治療的理想模型。 第四部分:骨骼肌肌源細(xì)胞自體移植治療壓力尿失禁的

12、實(shí)驗(yàn)研究 目的：用陰道擴(kuò)張的方法模擬難產(chǎn)建立壓力性尿失禁模型，探討自體骨骼肌肌源細(xì)胞(MDC)移植對(duì)壓力性尿失禁的治療作用。 方法：26只成年未生產(chǎn)過的雌性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(22只)和對(duì)照組(4只)，實(shí)驗(yàn)組陰道內(nèi)置水囊擴(kuò)張4h模擬難產(chǎn)，4周后，兩組均行尿流動(dòng)力學(xué)檢查測(cè)膀胱最大容量和漏尿點(diǎn)壓(LPP)及噴嚏實(shí)驗(yàn)。對(duì)噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性的10只大鼠再分為實(shí)驗(yàn)組(6只)和對(duì)照組(4只)，實(shí)驗(yàn)組采用差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)其MDC

13、，然后用攜帶Lac-Z基因的腺病毒轉(zhuǎn)染MDC，待轉(zhuǎn)染成功后將約5×106攜帶Lac-Z基因的MDC自體注射于膀胱頸及后尿道周圍，對(duì)照組則注射等量的生理鹽水。分別于注射后7d和15d再次行尿流動(dòng)力學(xué)檢查測(cè)膀胱最大容量和LPP及噴嚏實(shí)驗(yàn)，然后去頸處死取出膀胱及尿道，注射部位組織行組織學(xué)檢查及X-gal染色。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組自體MDC注射后7d和15d再次行尿流動(dòng)力學(xué)檢查測(cè)膀胱最大容量和LPP。膀胱最大容量和LPP較注射前有明顯提高(p

14、＜0.05)，噴嚏實(shí)驗(yàn)有兩只變?yōu)殛幮?，其余均有不同程度的改善。注射部位無明顯炎癥改變及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部細(xì)胞層數(shù)增多，經(jīng)X-gal染色顯示各時(shí)間點(diǎn)均可見大量的細(xì)胞被藍(lán)染，提示移植細(xì)胞在體內(nèi)成活。對(duì)照組膀胱最大容量和LPP有一只有輕微提高，噴嚏實(shí)驗(yàn)亦有一只有改善，其余均未見明顯變化。 結(jié)論：MDC自體膀胱頸及尿道周圍注射可使膀胱最大容量和LPP較注射前有明顯提高，且MDC可在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，提示自體MDC移植有可能成為壓力性尿失禁的