嵌合型豬圓環(huán)病毒1-2b轉染方法優(yōu)化及PCV1-2b 1B和1C疫苗免疫保護效力研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員，包括PCV1(Porcine circovirus type1，PCV1)和PCV2(Porcine circovirustype2，PCV2)兩種血清型。PCV1是豬腎細胞系的一種污染物，對豬無致病性;PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasti

2、ng syndrome，PMWS)及其他豬圓環(huán)病毒相關疾病（PCVAD）的主要病原。PCV2主要分為PCV2a和PCV2b兩個基因型，PCV2a包括2A-2E五個亞型;PCV2b包括1A、1B和1C三個亞型，其中1A、1B亞型的ORF2基因序列基本一致，進一步區(qū)分需比較ORF1序列。1C亞型的ORF2基因與1A、1B相比有較大差異，其Cap蛋白C末端出現(xiàn)一個賴氨酸(K)的延伸。
　　PCV2已在全世界豬群蔓延，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經

3、濟損失。疫苗接種是預防PCV2感染的有效手段。然而疫苗免疫不能完全阻斷PCV2的感染和傳播，而且商品化的疫苗價格普遍居高，制約著PCV2疫苗的廣泛使用。因此研發(fā)安全、高效、低價的疫苗產品是今后研究的主要方向。本研究使用電穿孔轉染法證實Dulac細胞能顯著提高嵌合型PCV1-2b拯救效率，突破病毒增殖的瓶頸;大量制備嵌合型PCV1-2b活病毒，動物試驗評估嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗的斷奶仔豬主動免疫及新生仔豬被動免疫保護效果。<

4、br>　　1.Dulac細胞拯救嵌合型PCV1-2b的轉染方法優(yōu)化
　　本研究通過優(yōu)化脂質體轉染法和電穿孔轉染法，將本室保存的pSK-dPCV1-2b重組質粒分別轉染Dulac細胞和PK-15細胞，旨在提高嵌合型豬圓環(huán)病毒PCV1-2b的拯救效率，為疫苗生產奠定基礎。
　　結果顯示，Dulac細胞轉染后的病毒滴度為PK-15細胞的100倍;Dulac細胞電轉染的優(yōu)化參數(shù)為250 V、400μs、6μg質粒DNA、電擊3次，各

5、因素對轉染效率的影響依次為電場強度、電擊次數(shù)、脈沖時間及質粒DNA含量。Dulac細胞脂質體轉染優(yōu)化結果為:在質粒DNA與轉染試劑比例為1∶3時，轉染效率最高。流式細胞術檢測Dulac細胞電轉染和脂質體轉染的感染率，結果陽性細胞數(shù)分別占55.6％和44.2％，提示兩種方法轉染Dulac細胞的效率均較高。分別將拯救的病毒在Dulac細胞和PK-15細胞上進行連續(xù)傳代，結果病毒滴度隨著傳代數(shù)呈上升趨勢，但Dulac細胞病毒滴度(104.44

6、-105.32)顯著高于PK-15細胞(101.90-103.38)。因此，嵌合型PCV1-2b在Dulac細胞中增殖滴度更高，優(yōu)化脂質體轉染法和電穿孔轉染法均能有效提高Dulac細胞的病毒拯救效率。
　　2.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗免疫保護效力比較
　　根據(jù)PCV2ORF1的保守序列，設計1對特異性引物和TaqMan探針，建立PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法，并評價其敏感性、特異性和重復性。結果顯示

7、，標準曲線的斜率為-3.55，相關系數(shù)R2為0.999，擴增效率為96.4％，具有良好的線性關系;該方法的敏感性為5.0 copies/μL;檢測的PCV1-2、PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV基因組DNA或cDNA均無擴增曲線;8份陽性樣品的變異系數(shù)在0.98％-1.03％之間。因此，本研究建立的PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法特異性強，敏感性高，重復性良好，為嵌合型PCV1-2b疫苗免疫保護效力評估提供了科

8、學有效方法。
　　用抗原含量為2×105.0 TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和2×104.0 TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b活疫苗分別免疫商品豬，并以商品化PCV2b全病毒滅活疫苗作對照，評估兩種疫苗的免疫保護效力。結果顯示，免疫組試驗豬均能迅速產生體液免疫反應，活疫苗免疫豬血清抗體和中和抗體產生更早，高水平抗體維持時間更長。TaqMan熒光定量PCR檢測攻毒后血清和腹股溝淋巴結PCV2 DNA拷貝數(shù)，

9、結果攻毒對照試驗豬血清和腹股溝淋巴結檢測到大量的PCV2核酸載量，活疫苗組攻毒后21d能完全消除PCV2增殖，而滅活疫苗組有1頭豬血清樣品檢測到PCV2核酸(105.55 copies/mL);滅活疫苗和活疫苗組均有2頭試驗豬腹股溝淋巴結檢測到PCV2 DNA載量（108.28、107.50 copies/g和105.93、105.57copies/g），嵌合型PCV1-2b活疫苗組低于滅活疫苗組，但差異不顯著(P＞0.05)。病理組織

10、學觀察結果顯示，攻毒對照豬可見嚴重的間質性支氣管肺炎病變，淋巴結出現(xiàn)淋巴細胞缺失和組織細胞浸潤等病理損傷，IHC檢測呈PCV2抗原陽性，而免疫組病變比攻毒對照組輕微。PCV2可通過口、鼻、糞尿等排泄物進行傳播，將病毒液接種試驗豬后發(fā)現(xiàn)，攻毒對照豬鼻拭子和肛拭子樣品中PCV2核酸載量顯著高于免疫組試驗豬(P＜0.05)。因此，嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗能夠誘導機體產生有效的免疫保護，降低PCV2水平傳播的風險，可作為防控PCV2

11、感染的候選疫苗。
　　3.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫母豬對所產仔豬免疫保護作用
　　嵌合型PCV1-2b滅活疫苗對斷奶仔豬的免疫保護效力已經在第二章得到證實，本研究將制備的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬，對其所產14日齡，28日齡和42日齡仔豬進行攻毒，評價新生仔豬的被動免疫保護效力。
　　結果顯示14日齡仔豬攻毒前母源抗體滴度最高，平均值為1∶300，28日齡和42日齡仔豬血清抗體水平逐漸下降，平均值

12、分別為1∶133和1∶70，至49日齡時血清中幾乎無母源抗體。14日齡仔豬僅在攻毒后14 d有1頭豬血清中檢測到低拷貝數(shù)的病毒載量(104.90copies/mL)，淋巴結觀察到輕微的淋巴細胞缺失，IHC檢測為陰性;28日齡仔豬母源抗體較低，PCV2攻毒后14 d和21 d分別有2頭豬出現(xiàn)不同程度的病毒血癥（分別為105.36copies/mL、106.39 copies/mL和107.84 copies/mL、107.90 copie

13、s/mL）;42日齡仔豬攻毒后，PCV2在體內的增殖得不到有效抑制，攻毒后7d血清中有1頭豬檢測到PCV2核酸拷貝數(shù)，21 d的血清和淋巴結病毒載量接近攻毒組水平，平均值分別達106.31 copies/mL和1010.77copies/g,組織病理學發(fā)現(xiàn)淋巴細胞流失嚴重并伴有巨噬細胞浸潤，IHC檢測到棕黃色陽性細胞。因此，本研究證明了嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬，14日齡仔豬獲得良好的保護效力，28和42日齡仔豬被動免疫保

14、護降低;將仔豬的首免日期定在28日齡左右。
　　4.嵌合型PCV1-2b1B和1C亞型滅活疫苗免疫保護效力比較
　　本研究以本室保存的pSK-sPCV1-2b1C重組質粒為骨架，構建pSK-dPCV1-2b1B感染性克隆，電穿孔轉染法拯救嵌合型PCV1-2b1B病毒，動物試驗評價兩種嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫保護效力的差異。
　　生長動力學顯示，兩株嵌合型PCV1-2b呈現(xiàn)相似的增殖特性。試驗豬免疫后產生快速的體

15、液免疫應答，能顯著降低機體PCV2病毒載量，但免疫組之間無顯著差異(P＞0.05)。嵌合型PCV1-2b1B滅活疫苗誘導的熒光抗體和中和抗體略高，血清病毒含量較低，在攻毒后14d和21 d能完全抑制PCV2b增殖，腹股溝淋巴結不攜帶PCV2b核酸，IHC檢測呈陰性;嵌合型PCV1-2b1C滅活疫苗組攻毒后21 d不能完全抑制病毒增殖，1頭豬血清中檢測到病毒載量（105.75 copies/mL）;腹股溝淋巴結亦有1頭豬可檢測到PCV2b