版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus,簡(jiǎn)稱A.caldus)是一種化能自養(yǎng)細(xì)菌,能夠氧化元素硫和各種還原性的無機(jī)硫化合物,并從中獲得能量和還原力,以此來完成自身的生長(zhǎng)代謝。A.caldus是生物冶金工業(yè)中常見的應(yīng)用菌株,其生長(zhǎng)的最適pH和最適溫度分別為1.5-2.5和40-50℃。A.caldus體內(nèi)存在一套復(fù)雜而又高效的無機(jī)硫化合物的代謝系統(tǒng)。其中,硫代硫酸鹽又是在整個(gè)硫代謝系統(tǒng)中重要的中間代謝物,它能夠
2、通過連四硫酸鹽介導(dǎo)的硫代硫酸鹽代謝途徑(S4I pathway)進(jìn)行代謝。因此,揭示S4I途徑的作用和調(diào)控機(jī)制,對(duì)于深入了解A.caldus整個(gè)硫代謝系統(tǒng),以及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,具有重要的的理論指導(dǎo)意義。
S4I途徑中包含有兩種酶:硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(Tqo或DoxDA)和連四硫酸鹽水解酶(TetH)。這兩種酶的編碼基因位于同一個(gè)基因簇上(tetH基因簇)。通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),在tetH基因簇上,tetH基因前還存在rsr
3、R和rsrS兩個(gè)基因,編碼一套雙組分的調(diào)控系統(tǒng)。因此,結(jié)合A.caldus在單質(zhì)硫培養(yǎng)過程硫代謝相關(guān)基因及一些調(diào)控基因的明顯的變化規(guī)律,推斷雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR極有可能調(diào)控S4I途徑。
本論文即針對(duì)上述要解決的問題,從以下幾個(gè)方面開展了研究工作:
一、A.caldus中培養(yǎng)過程的全基因組表達(dá)譜分析
A.caldus在單質(zhì)硫?yàn)槟茉吹呐囵B(yǎng)過程中,隨著單質(zhì)硫的活化氧化,產(chǎn)生各種可代謝的硫化合物,進(jìn)而開
4、啟相關(guān)代謝途徑。為了闡釋在單質(zhì)硫培養(yǎng)過程中,各種硫代謝途徑及其相關(guān)調(diào)控基因在整個(gè)過程中的轉(zhuǎn)錄變化情況,利用全基因組芯片對(duì)單質(zhì)硫培養(yǎng)過程(2天、4天、6天8天和10天)進(jìn)行了系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明A.caldus的硫代謝相關(guān)基因及一些調(diào)控基因具有明顯的變化規(guī)律,為系統(tǒng)研究硫代謝的調(diào)控機(jī)制提供了思路和線索,為從整體上認(rèn)識(shí)理解硫代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。在分析部分調(diào)控基因的過程轉(zhuǎn)錄情況時(shí),發(fā)現(xiàn)分別有兩套雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能與硫代謝相關(guān),其中
5、,雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR可能調(diào)控A.caldus的S4I途徑。
二、使用無痕敲除技術(shù)進(jìn)行雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR編碼基因的無痕敲除
本文基于同源重組的原理,使用無痕敲除技術(shù),分別通過構(gòu)建自殺質(zhì)粒pSDUDI∷rsrR(UHA+ DHA)和pSDUDI∷rsrS(UHA+DHA),經(jīng)過接合轉(zhuǎn)移操作,使用同源臂內(nèi)測(cè)引物、外側(cè)基因和基因內(nèi)部引物篩選驗(yàn)證,成功獲得了rsrR和rsrS基因的敲除株。敲除株的獲
6、得,對(duì)于研究雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR的功能是最基本而又最重要的步驟。
三、△rsrR、ArsrS生長(zhǎng)曲線分析
在獲得△rsrR、△rsrS敲除株后,分別檢測(cè)了其在以硫粉或連四硫酸鹽作為底物能源時(shí)的生長(zhǎng)狀況,分析了與野生型的生長(zhǎng)差異。結(jié)果在硫粉培養(yǎng)時(shí),兩個(gè)敲除株相對(duì)于野生型沒有表現(xiàn)出明顯的差異。然而,在連四硫酸鹽培養(yǎng)時(shí),分別表現(xiàn)出了2天和4天的生長(zhǎng)延遲。另外,針對(duì)這兩個(gè)敲除株構(gòu)建的回補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)曲線,表明在被敲
7、除的基因得到回補(bǔ)后,生長(zhǎng)曲線又恢復(fù)到與野生型一致。這一結(jié)果對(duì)于分析和推斷rsrR、rsrS基因在硫代謝調(diào)控,尤其是S4I途徑中的作用具有重要意義。
四、連四硫酸鹽刺激時(shí)A.caldus中tetH基因簇基因表達(dá)研究
S4I途徑是目前硫氧化細(xì)菌中唯一明確的能夠代謝連四硫酸鹽的途徑,而RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)又極有可能調(diào)控該途徑。因此,在使用硫粉培養(yǎng)A.caldus時(shí),通過加入連四硫酸鹽刺激,使用RT-qPCR檢測(cè)
8、tetH基因簇中基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。結(jié)果野生型的tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后均發(fā)生了明顯的表達(dá)上調(diào);而ArsrR、△rsrS敲除株,由于雙組分調(diào)控系統(tǒng)的缺失,使得調(diào)控途徑中斷,導(dǎo)致tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后并沒有出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化。從而可以推斷和初步驗(yàn)證RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于S4I途徑的正向調(diào)控功能。
五、A.caldus中tetH基因簇的分析研究
在喜溫硫桿菌中,S4I途徑是
9、硫代謝系統(tǒng)的重要組成部分,該途徑包含的連四硫酸鹽水解酶(TetH)和硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(DoxDA),在多種硫氧化微生物中都存在。對(duì)喜溫硫桿菌屬和其他硫氧化細(xì)菌,甚至含有相似代謝途徑的古菌進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)喜溫硫桿菌在tetH和doxDA基因前獨(dú)特的進(jìn)化出了一套R(shí)srS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)的編碼基因。這對(duì)于更有序高效的調(diào)控復(fù)雜的硫氧化系統(tǒng)是有利且必須的。
另一方面,通過生物信息學(xué)分析喜溫硫桿菌中tetH基因簇的啟動(dòng)子情況
10、。并通過構(gòu)建探測(cè)質(zhì)粒進(jìn)行外源測(cè)GusA酶活,內(nèi)源RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)gusA基因轉(zhuǎn)錄等方式,驗(yàn)證了可能的啟動(dòng)子。而且通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)確定了doxDA的啟動(dòng)子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。這些工作對(duì)于從整體上了解整個(gè)tetH基因簇的基因轉(zhuǎn)錄以及對(duì)于揭示調(diào)控的機(jī)制具有一定的意義。
六、RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于S4I途徑的調(diào)控研究
通過優(yōu)化的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證了RsrR蛋白與tetH前的啟動(dòng)子序列
11、之間的相互作用。另一方面,構(gòu)建一系列報(bào)告基因探測(cè)質(zhì)粒,pJRD-P360IRS-gusA,pJRD-P148IRS-gusA和pJRD-P90-gusA,在A.caldus體內(nèi)驗(yàn)證了RsrR蛋白與tetH前的啟動(dòng)子序列之間的相互作用。
結(jié)合生物信息學(xué)分析,初步確定tetH前的啟動(dòng)子上一段19 bp的反向重復(fù)序列(IRS,AACACCTGTTACACCTGTT)極有可能是RsrR蛋白的調(diào)控序列。然而,通過DNase I足跡實(shí)驗(yàn),
12、則確定了一段22 bp的調(diào)控序列。這兩種實(shí)驗(yàn)方法各有優(yōu)勢(shì)和不足,下一步工作會(huì)通過調(diào)控序列關(guān)鍵位點(diǎn)突變等方法來確定RsrR蛋白準(zhǔn)確的調(diào)控序列。
七、A.caldus中RsrS和RsrR結(jié)構(gòu)及cross-talk功能的初步研究
本文通過進(jìn)化樹鄰接法分析了RsrS和RsrR兩個(gè)蛋白可能的來源或者歸類,并對(duì)其進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)模擬和疊合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)與涉及滲透壓的雙組分調(diào)控系統(tǒng)EnvZ-Omp
13、R具有高度相似性。這些分析結(jié)果是兩者之間能夠發(fā)生共調(diào)控或這cross-talk現(xiàn)象的重要的理論基礎(chǔ)。結(jié)合之前驗(yàn)證敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長(zhǎng)延遲的生理特性,有理由相信極有可能是EnvZ-OmpR在RsrS-RsrR缺失時(shí),保證了兩個(gè)敲除株在連四硫酸鹽里的生長(zhǎng)。同時(shí),通過分析得出的幾個(gè)有關(guān)的雙組分蛋白(RR),與tetH基因的啟動(dòng)子序列的EMSA實(shí)驗(yàn),結(jié)果A5904_2590(OmpR)確實(shí)能夠結(jié)合tetH前的啟動(dòng)子序列。另一方面,分析了
14、RsrR蛋白結(jié)合DNA片段的HTH結(jié)構(gòu)域中一些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。這些分析和研究結(jié)果這對(duì)于解釋連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長(zhǎng)延遲的現(xiàn)象和完善S4l途徑的調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。
八、△rsrR、△rsrS中硫代謝相關(guān)基因及部分調(diào)控基因的研究
A.caldus中S4I途徑涉及到連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉(zhuǎn)化,而硫代硫酸鹽又是整個(gè)硫代謝系統(tǒng)的重要的中間代謝物,說明S4I途徑與其他的硫氧化途徑有密切的聯(lián)系。目前的研究表明了雙組分
15、調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR對(duì)S4I途徑的調(diào)控作用。因此,通過RT-qPCR檢測(cè)△rsrR、△rsrS敲除株中硫氧化基因的轉(zhuǎn)錄變化情況,對(duì)于分析S4I途徑與其他的硫氧化途徑之間的影響和聯(lián)系具有重要意義。
另一方面,△rsrR、△rsrS敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長(zhǎng)延遲。目前的研究結(jié)果表明很有可能是與其他雙組分調(diào)控系統(tǒng)間的共調(diào)控或者cross-talk相關(guān)。因此,也對(duì)敲除株中其他雙組分調(diào)控系統(tǒng)及單組分調(diào)控蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄
16、變化情況進(jìn)行了檢測(cè)。
RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn), rsrS和rsrR的敲除對(duì)于硫代謝相關(guān)基因及部分調(diào)控基因均有影響。但是,不管是影響的基因數(shù)目還是影響的基因表達(dá)變化的程度上,rsrR的敲除產(chǎn)生的影響要明顯大于rsrS的敲除帶來的影響。
九、A.caldus中RsrS-RsrR調(diào)控S4I途徑的基本模型的提出
通過整個(gè)工作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證,結(jié)合生物信息學(xué)分析,提出了A.caldus中RsrS-RsrR調(diào)控S4I途徑
17、的基本模型。在A.caldus硫代謝系統(tǒng)中的S4I途徑中,雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的組氨酸激酶RsrS的感受結(jié)構(gòu)域從連四硫酸鹽感受刺激,使其DHp結(jié)構(gòu)域中的活性組氨酸位點(diǎn)從ATP獲得磷酸基團(tuán)后被活化;經(jīng)過催化結(jié)構(gòu)域CA的催化作用,將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的調(diào)控蛋白R(shí)srR的信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域REC保守的活性天冬氨酸Asp(D)位點(diǎn)上并被活化;RsrR形成同源二聚體,結(jié)合到tetH基因前啟動(dòng)子序列中的調(diào)控序列上;激活RNA聚合酶,調(diào)控tetH
18、基因簇的轉(zhuǎn)錄。tetH和doxDA基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)產(chǎn)生TetH和DoxDA蛋白,進(jìn)入周質(zhì)空間后,實(shí)現(xiàn)了連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉(zhuǎn)化,從而參與到整個(gè)硫代謝氧化系統(tǒng)中。
本文通過A.caldusMTH-04全基因組的芯片表達(dá)譜分析,分析了喜溫硫桿菌在生長(zhǎng)過程中硫代謝及相關(guān)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。通過基因無痕敲除技術(shù)成功構(gòu)建了雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR的敲除菌株;通過體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 連四硫酸鹽硫代硫酸化與連五硫酸鹽亞硫酸化反應(yīng)動(dòng)力學(xué).pdf
- 連五硫酸鹽的硫代硫酸化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及機(jī)理分析.pdf
- 置換法回收硫脲和硫代硫酸鹽中的金.pdf
- 基于控制硫代硫酸鹽消耗的強(qiáng)化浸金研究.pdf
- 硫代硫酸鹽對(duì)厭氧脫氮除硫工藝的影響研究.pdf
- 28277.連多硫酸鹽亞硫酸化及硫代硫酸化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析
- 硫酸鹽的測(cè)定
- 硫代硫酸鹽浸金的機(jī)理及穩(wěn)定性研究.pdf
- 硫酸鹽侵蝕機(jī)理及抗硫酸鹽侵蝕測(cè)試方法的研究.pdf
- 硫代硫酸鹽鍍銀層制備及高溫抗變色性能研究.pdf
- 輝銀礦無氨硫代硫酸鹽法浸出機(jī)理研究.pdf
- 生物法處理含硫酸鹽酸性廢水及回收單質(zhì)硫工藝
- 排硫硫桿菌亞硫酸鹽受體氧化還原酶的純化和性質(zhì).pdf
- 硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽還原酶的初步研究.pdf
- 大氣中硫酸和硫酸鹽的測(cè)定方法
- 硫代硫酸鹽無氰鍍銀層的制備及電沉積機(jī)理研究.pdf
- 10097.硫酸鹽還原菌還原分解硫酸鹽礦物的機(jī)制及環(huán)境意義
- 外文翻譯---厭氧的硫代硫酸鹽浸出法-就地浸金工藝的研究
- 外文翻譯---厭氧的硫代硫酸鹽浸出法-就地浸金工藝的研究
- 外文翻譯---厭氧的硫代硫酸鹽浸出法-就地浸金工藝的研究
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論