落葉松miR396對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育的調(diào)控及GRF基因的表達(dá)研究.pdf

1、落葉松（Larix leptolepis）是我國北方中高山地區(qū)重要針葉速生用材造林樹種，是重要的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)樹種。因此，加大對(duì)落葉松優(yōu)良品種的繁育，具有重要意義。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是它理想的繁殖方式。而在落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，存在胚性不穩(wěn)定、畸形胚發(fā)生率高、生根率低等問題，因此，亟需關(guān)于體細(xì)胞胚發(fā)育的研究來闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。
　　研究表明miR396在多個(gè)物種中具有高度保守性，它通過負(fù)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在子葉與葉片的發(fā)育、根

2、的生長等方面起重要的調(diào)控作用，但其在裸子植物中的功能研究卻還未見報(bào)道。因此，本研究以落葉松體胚為材料，進(jìn)行miR396及靶基因growth regulatingfactors(GRFs)的研究，為揭示體細(xì)胞胚發(fā)育過程中關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究成果，具體如下:
　　(1)從落葉松中分離克隆了miR396靶基因LaGRF1，LaGRF2和LaGRF3。序列分析發(fā)現(xiàn)皆具有兩個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域:QLQ(Gln Leu Gln)與

3、WRC(Trp Arg Cys)，其中QLQ結(jié)構(gòu)域主要參與蛋白間的相互作用，WRC結(jié)構(gòu)域是DNA結(jié)合區(qū)，且在WRC的3'末端含有miR396的結(jié)合位點(diǎn)。
　　(2)qRT-PCR結(jié)果表明，miR396與LaGRFs在落葉松體胚發(fā)育中差異性表達(dá)，且呈階段性（子葉胚時(shí)期）負(fù)相關(guān)性。從原胚團(tuán)時(shí)期到晚期單胚期，二者的表達(dá)都較低，未顯現(xiàn)明顯相關(guān)性與規(guī)律性，而進(jìn)入子葉胚時(shí)期后，二者呈此消彼長的負(fù)調(diào)控關(guān)系，這暗示著miR396可能是通過調(diào)節(jié)La

4、GRFs的表達(dá)量對(duì)落葉松子葉胚的發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。
　　(3)將落葉松體細(xì)胞子葉胚的形態(tài)發(fā)育與LaGRFs表達(dá)模式結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)子葉輪廓初現(xiàn)到子葉不斷伸展延伸，最后至發(fā)育成熟的過程，LaGRFs的表達(dá)量急劇增加，并在子葉胚中期達(dá)到峰值，之后保持在較高水平。而這一過程，子葉胚主要是增加細(xì)胞數(shù)目與增大細(xì)胞體積，橫向與縱向地生長發(fā)育，因此，推測在落葉松子葉胚發(fā)育中miR396可能通過負(fù)調(diào)節(jié)LaGRFs影響子葉胚細(xì)胞的數(shù)目與大小。
　　

5、(4)頭孢敏感度檢測初步篩選出S98與S287做為轉(zhuǎn)化材料，頭孢濃度為600 mg/L。結(jié)合最終轉(zhuǎn)化結(jié)果，確定S287可作為優(yōu)良轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
　　(5)以S287為轉(zhuǎn)化材料，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紙片覆蓋侵染遺傳轉(zhuǎn)化方法，以頭孢霉素濃度600mg/L的篩選條件成功獲取轉(zhuǎn)基因抗性系。轉(zhuǎn)基因系中pre-miR396、miR396的表達(dá)顯著上調(diào)，LaGRFs的表達(dá)顯著下調(diào)，子葉輪廓不規(guī)則，子葉內(nèi)部細(xì)胞大小不規(guī)則，根端組織異常，表現(xiàn)出低的發(fā)芽