落葉松miR396對體細胞胚發(fā)育的調控及GRF基因的表達研究.pdf

1、落葉松（Larix leptolepis）是我國北方中高山地區(qū)重要針葉速生用材造林樹種，是重要的生態(tài)與經濟樹種。因此，加大對落葉松優(yōu)良品種的繁育，具有重要意義。體細胞胚胎發(fā)生途徑是它理想的繁殖方式。而在落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中，存在胚性不穩(wěn)定、畸形胚發(fā)生率高、生根率低等問題，因此，亟需關于體細胞胚發(fā)育的研究來闡明其調控網絡機制。
　　研究表明miR396在多個物種中具有高度保守性，它通過負調節(jié)靶基因的表達，在子葉與葉片的發(fā)育、根

2、的生長等方面起重要的調控作用，但其在裸子植物中的功能研究卻還未見報道。因此，本研究以落葉松體胚為材料，進行miR396及靶基因growth regulatingfactors(GRFs)的研究，為揭示體細胞胚發(fā)育過程中關鍵調控機制提供理論依據。主要研究成果，具體如下:
　　(1)從落葉松中分離克隆了miR396靶基因LaGRF1，LaGRF2和LaGRF3。序列分析發(fā)現皆具有兩個高度保守的結構域:QLQ(Gln Leu Gln)與

3、WRC(Trp Arg Cys)，其中QLQ結構域主要參與蛋白間的相互作用，WRC結構域是DNA結合區(qū)，且在WRC的3'末端含有miR396的結合位點。
　　(2)qRT-PCR結果表明，miR396與LaGRFs在落葉松體胚發(fā)育中差異性表達，且呈階段性（子葉胚時期）負相關性。從原胚團時期到晚期單胚期，二者的表達都較低，未顯現明顯相關性與規(guī)律性，而進入子葉胚時期后，二者呈此消彼長的負調控關系，這暗示著miR396可能是通過調節(jié)La

4、GRFs的表達量對落葉松子葉胚的發(fā)育進行調控。
　　(3)將落葉松體細胞子葉胚的形態(tài)發(fā)育與LaGRFs表達模式結合分析，發(fā)現子葉輪廓初現到子葉不斷伸展延伸，最后至發(fā)育成熟的過程，LaGRFs的表達量急劇增加，并在子葉胚中期達到峰值，之后保持在較高水平。而這一過程，子葉胚主要是增加細胞數目與增大細胞體積，橫向與縱向地生長發(fā)育，因此，推測在落葉松子葉胚發(fā)育中miR396可能通過負調節(jié)LaGRFs影響子葉胚細胞的數目與大小。
　　

5、(4)頭孢敏感度檢測初步篩選出S98與S287做為轉化材料，頭孢濃度為600 mg/L。結合最終轉化結果，確定S287可作為優(yōu)良轉化細胞系。
　　(5)以S287為轉化材料，建立了農桿菌介導的紙片覆蓋侵染遺傳轉化方法，以頭孢霉素濃度600mg/L的篩選條件成功獲取轉基因抗性系。轉基因系中pre-miR396、miR396的表達顯著上調，LaGRFs的表達顯著下調，子葉輪廓不規(guī)則，子葉內部細胞大小不規(guī)則，根端組織異常，表現出低的發(fā)芽