miR396介導(dǎo)的bHLH74調(diào)控在擬南芥根發(fā)育中的功能研究.pdf

1、擬南芥miR396家族由miR396a和miR396b兩個(gè)成員組成，分別由兩個(gè)不同的基因MIR396a和MIR396b編碼。GRF(growth-regulatingfactors)家族的七個(gè)成員和一個(gè)bHLH(basicHelix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子bHLH74是miR396作用的靶基因。miR396-靶基因模塊通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖，在擬南芥葉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　 為了探索miR396在擬南芥根生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，

2、揭示MIR396基因家族不同成員功能差異性的原因，我們進(jìn)行了MIR396及其靶基因bHLH74的表達(dá)分析，研究了miRNA及靶基因功能缺陷突變體擬南芥的根發(fā)育表型，獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.mir396a-1突變體的篩選和表型觀察經(jīng)兩輪PCR篩選獲得純合的mir396a-1突變體之后，qRT-PCR檢測(cè)表明突變體中MIR396a前體和miR396成熟體的表達(dá)量均下降。通過(guò)表型觀察發(fā)現(xiàn)，mir396a-1突變體的根長(zhǎng)明顯高于

3、野生型，這與35S∶MIR396a轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為短根表型剛好相反，由此推斷miR396a在擬南芥根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。
　　 2.靶基因bHLH74在擬南芥根生長(zhǎng)調(diào)控中的作用對(duì)啟動(dòng)子報(bào)告株系probHLH74∶GUS的擬南芥幼苗進(jìn)行GUS組織染色觀察，結(jié)果表明靶基因在葉片以及根部都有表達(dá)，其主要分布于主根的維管束和新生側(cè)根。
　　 通過(guò)同義突變bHLH74基因中miR396的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建了35S∶mbHLH

4、74轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)獲得bHLH74表達(dá)量升高的轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)與bhlh74-1突變體進(jìn)行表型觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)，35S∶mbHLH74擬南芥表現(xiàn)為根長(zhǎng)高于野生型，而bhlh74-1的主根長(zhǎng)度短于野生型。進(jìn)而對(duì)野生型、35S∶mbHLH74轉(zhuǎn)基因株系和bhlh74-1突變體進(jìn)行根部細(xì)胞的觀察和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明miR396是通過(guò)介導(dǎo)bHLH74的抑制對(duì)根部分生區(qū)的細(xì)胞增殖進(jìn)行負(fù)調(diào)控來(lái)影響根的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　

5、3.MIR396a和MIR396b前體產(chǎn)生的sRNA分析通過(guò)對(duì)35S∶MIR396a和35S∶MIR396b轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行smallRNA測(cè)序分析，并將測(cè)序結(jié)果與野生型擬南芥數(shù)據(jù)比對(duì)分析，結(jié)果表明在35S∶MIR396a和35S∶MIR396b轉(zhuǎn)基因擬南芥中分別形成了不同的次生sRNA以及miRNA的變異體。煙草注射的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同的sRNA對(duì)靶基因的抑制效率不同。此外，MIR396不同基因座的過(guò)表達(dá)還影響多個(gè)其它miRNA