miR396介導(dǎo)的bHLH74調(diào)控在擬南芥根發(fā)育中的功能研究.pdf

1、擬南芥miR396家族由miR396a和miR396b兩個成員組成，分別由兩個不同的基因MIR396a和MIR396b編碼。GRF(growth-regulatingfactors)家族的七個成員和一個bHLH(basicHelix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子bHLH74是miR396作用的靶基因。miR396-靶基因模塊通過調(diào)控細胞增殖，在擬南芥葉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　 為了探索miR396在擬南芥根生長發(fā)育中的功能，

2、揭示MIR396基因家族不同成員功能差異性的原因，我們進行了MIR396及其靶基因bHLH74的表達分析，研究了miRNA及靶基因功能缺陷突變體擬南芥的根發(fā)育表型，獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.mir396a-1突變體的篩選和表型觀察經(jīng)兩輪PCR篩選獲得純合的mir396a-1突變體之后，qRT-PCR檢測表明突變體中MIR396a前體和miR396成熟體的表達量均下降。通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，mir396a-1突變體的根長明顯高于

3、野生型，這與35S∶MIR396a轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為短根表型剛好相反，由此推斷miR396a在擬南芥根生長發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。
　　 2.靶基因bHLH74在擬南芥根生長調(diào)控中的作用對啟動子報告株系probHLH74∶GUS的擬南芥幼苗進行GUS組織染色觀察，結(jié)果表明靶基因在葉片以及根部都有表達，其主要分布于主根的維管束和新生側(cè)根。
　　 通過同義突變bHLH74基因中miR396的結(jié)合位點，構(gòu)建了35S∶mbHLH

4、74轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，通過qRT-PCR檢測獲得bHLH74表達量升高的轉(zhuǎn)基因株系。通過與bhlh74-1突變體進行表型觀察對比發(fā)現(xiàn)，35S∶mbHLH74擬南芥表現(xiàn)為根長高于野生型，而bhlh74-1的主根長度短于野生型。進而對野生型、35S∶mbHLH74轉(zhuǎn)基因株系和bhlh74-1突變體進行根部細胞的觀察和統(tǒng)計分析，結(jié)果表明miR396是通過介導(dǎo)bHLH74的抑制對根部分生區(qū)的細胞增殖進行負調(diào)控來影響根的生長發(fā)育。
　　

5、3.MIR396a和MIR396b前體產(chǎn)生的sRNA分析通過對35S∶MIR396a和35S∶MIR396b轉(zhuǎn)基因擬南芥進行smallRNA測序分析，并將測序結(jié)果與野生型擬南芥數(shù)據(jù)比對分析，結(jié)果表明在35S∶MIR396a和35S∶MIR396b轉(zhuǎn)基因擬南芥中分別形成了不同的次生sRNA以及miRNA的變異體。煙草注射的瞬時轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果顯示不同的sRNA對靶基因的抑制效率不同。此外，MIR396不同基因座的過表達還影響多個其它miRNA