新型抗凝血多肽Hirulog-S的合成及質(zhì)量分析.pdf

1、Hirulog-S((D)FPRP—GK(Stearic)GG-QGDFEPIPEDAYDE)是本課題組根據(jù)比伐盧定缺點(diǎn)和水蛭素Ⅲ型優(yōu)點(diǎn)而設(shè)計的高效新型抗凝血多肽,其中含有一個疏水性的硬脂酸側(cè)鏈。它與臨床藥物比伐盧定(Hirulog-1)相比具有顯著優(yōu)點(diǎn):(1)抗凝活性是比伐盧定的10倍以上,半衰期適中(8小時),高于比伐盧定18倍(半衰期為25分鐘),且作用平緩,(2)一天一次或兩次靜脈注射可保持很高的抗凝活性,用量低于比伐盧定10倍

2、以上,能克服比伐盧定用量大(250 mg／瓶)、半衰期短、連續(xù)靜脈滴注的缺點(diǎn)。用于預(yù)防溶栓后再栓塞,或深靜脈血栓形成等,特別適合于PCI手術(shù)及與溶栓藥共用抗凝。因此,對Hirulog-S質(zhì)量分析及凍干粉針劑的研究具有非常重要的意義,為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 本論文在已有工作基礎(chǔ)上開展了如下研究:(1)利用手工固相方法,合成了四批Hirulog-S多肽；(2)本論文參考中國藥典、相關(guān)文獻(xiàn)及書籍,建立了適合Hirulog-

3、S原料藥的質(zhì)量分析方法,其質(zhì)量研究工作包括理化常數(shù)測定、鑒別、純度檢驗、含量測定及穩(wěn)定性研究等,并建立起質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案；(3)研究了Hirulog-S凍干粉針劑的配方并對其進(jìn)行了質(zhì)量研究和穩(wěn)定性試驗等。
　　 本論文取得的主要結(jié)果有:
　　 1.合成硬脂酸修飾的Fmoc-賴氨酸約54.3 g,為Hirulog-S多肽的規(guī)模合成提供了氨基酸原料。
　　 2.使用手工固相法合成Hirulog-S多肽(理論分子量2685

4、.37 Da),采用Rink-樹脂(取代率0.73 mmol／g)作為固相載體,原料為Fmoc保護(hù)的天然氨基酸,20％哌啶作為脫保護(hù)劑,HOBT／HBTU／DIEA作縮合劑,縮合完成后進(jìn)行裂解得到目標(biāo)產(chǎn)物。共合成四批,每批規(guī)模分別為5、10、10、20 mmol,粗產(chǎn)量分別為9.36、15.40、22.60和42.92 g,粗產(chǎn)率的平均值為73％。經(jīng)高效液相純化,目前已得到13.8 g。
　　 3.原料藥的質(zhì)量分析
　　

5、 (1)通過對Hirulog-S多肽的氨基酸組成分析,序列測定及質(zhì)譜鑒定表明它的一級結(jié)構(gòu)與理論計算相符,比旋度結(jié)果表明此肽為左旋性藥物。
　　 (2)通過不同色譜柱的等度沈脫和梯度探索,獲得Hirulog-S分析的較理想的洗脫梯度(HPLC)。在25.4～508μg／mL范圍內(nèi),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),樣品濃度(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,方程為:Y=19.289 X-175.08,R2=0.9990,峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

6、測定Hirulog-S樣品中的含量及有關(guān)物質(zhì),結(jié)果三批樣品(批號20100301,20100302,20100303)含量分別是99.7％±1.3％,100.4％±1.1％,99.4％±0.96％,總有關(guān)物質(zhì)分別在0.59％～0.97％之間。
　　 (3)采用卡爾菲休庫侖滴定法準(zhǔn)確測定了三批樣品及對照品(批號:20100304)中的水分含量。所得的結(jié)果分別為2.3％±0.05％,2.1％±0.06％,2.1％±0.11％,2.3

7、％±0.12％,批次之間水分含量均勻。
　　 (4)采用RP-HPLC方法,進(jìn)行本品中TFA含量的測定,結(jié)果分別為12.08％±0.15％,9.08％±0.14％,12.76％±0.21％,10.93％±0.08％。
　　 (5)使用硫代乙酰胺法和古蔡氏法測定重金屬(Ag、Pb和As)含量均小于10 ppm,符合藥物申報要求。
　　 (6)用色譜法進(jìn)行了Hirulog-S穩(wěn)定性試驗,結(jié)果表明Hirulog—S在一

8、定的環(huán)境下是穩(wěn)定的。
　　 4.凍干粉針劑的配方研究及質(zhì)量分析
　　 (1)通過篩選獲得了Hirulog-S的凍干粉針劑的配方為:每瓶25 mg多肽,12.5 mg甘露醇,用0.5 M的碳酸鈉調(diào)節(jié)pH為8左右,凍干得白色粉末。
　　 (2)對Hirulog—S凍干粉進(jìn)行了質(zhì)量分析以及穩(wěn)定性研究。
　　 5.在質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上,制訂了Hirulog-S原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案,經(jīng)檢驗,該標(biāo)準(zhǔn)能有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量