pH敏感mPEG-PCL-PGA的合成、表征及在藥物傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用.pdf

1、高分子合成化學(xué)的快速發(fā)展使得合成的生物可降解聚合物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。聚酯類聚合物如聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)等都是比較常見的合成的聚合物嵌段，這些材料合成簡單，對人體毒性較低，具有生物可降解性，因此作為藥物傳遞載體有著較為廣闊的應(yīng)用前景。隨著藥物傳遞系統(tǒng)對載體要求的日益提高，近年來聚肽嵌段引起人們的廣泛關(guān)注，此類聚合物降解后的單體可被生物體利用，且隨著外界環(huán)境如pH、溫度的變化

2、可以改變自身的二級構(gòu)象，引起嵌段水溶性的改變，引起聚集體結(jié)構(gòu)的聚集-解聚行為或者聚合物聚集體形態(tài)的改變。
　　兩親性聚合物由親水嵌段及疏水嵌段構(gòu)成，其組成中親疏水嵌段的比例不同，組裝體的形態(tài)（膠束、納米粒、囊泡）也各不相同。聚合物囊泡與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似，是由兩親性聚合物自組裝形成的完整閉合雙層結(jié)構(gòu)。相比于膠束和納米粒，囊泡的內(nèi)部為親水腔，能夠?qū)⒌鞍追肿拥扔H水性藥物包裹起來，避免外界環(huán)境對藥物活性的影響。與具有類似結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體相比，聚合

3、物囊泡的膜較厚，體系穩(wěn)定，而脂質(zhì)體的組成成分磷脂易氧化發(fā)生內(nèi)容物的泄漏。此外，聚合物囊泡的性質(zhì)可通過改變聚合物嵌段的種類和長度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　鹽酸多柔比星是臨床上治療多種腫瘤的一線藥物，廣泛用于治療急性白血病、淋巴癌、軟組織和骨肉癌、兒童惡性腫瘤及多種成人實(shí)體瘤，尤其對乳腺癌和肺癌的治療效果較為明顯，但是應(yīng)用多柔比星的患者會出現(xiàn)各種各樣的副作用如惡心、嘔吐、骨髓抑制等，最為嚴(yán)重的是對病人的心臟毒性。為了降低鹽酸多柔比星的毒副作用，

4、常將藥物包載于載體中進(jìn)而降低其在正常組織中的分布，使較多的藥物運(yùn)送到腫瘤部位。為了實(shí)現(xiàn)藥物的腫瘤靶向，可以利用腫瘤部位pH值低的特點(diǎn)，將鹽酸多柔比星包載于pH敏感載體中，使其在腫瘤部位能夠釋放較多的藥物。而且已有報(bào)道稱，將鹽酸多柔比星包裹于聚合物囊泡中，能降低其心臟毒性。
　　本課題以mPEG、ε-CL、L-谷氨酸-γ-芐酯-N-羧酸酐為原料合成三嵌段聚合物mPEG-PCL-PGA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇合適的親、疏水鏈段比例，使合成的

5、聚合物在水溶液中可以自發(fā)形成囊泡。聚乙二醇(mPEG)作為親水嵌段能夠抵抗血漿蛋白吸附，其伸展在囊泡表面能夠賦予囊泡“隱形”的特點(diǎn)，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，達(dá)到長循環(huán)的目的;聚己內(nèi)酯(PCL)作為疏水嵌段，各單體間其通過易水解的酯鍵相連接，其結(jié)構(gòu)相對柔軟，容易被體內(nèi)酶分解代謝;聚谷氨酸(PGA)嵌段在中性條件下，呈現(xiàn)水溶性的無規(guī)卷曲構(gòu)象(coil)，而在酸性條件下則會呈現(xiàn)水溶性差的α螺旋(α-helical)構(gòu)象，PGA嵌段具有pH敏感

6、性從而賦予其所形成的聚合物囊泡具有pH敏感性，實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位(pH較低)釋藥的目的。
　　本論文的主要研究內(nèi)容如下:
　　1.三嵌段pH敏感聚合物mPEG-PCL-PGA的合成、表征及聚集行為研究
　　利用開環(huán)聚合反應(yīng)分三大步合成了三嵌段pH敏感聚合物mPEG-PCL-PGA。首先以單甲氧基聚乙二醇為大分子起始物，ε-己內(nèi)酯為單體，辛酸亞錫為催化劑，開環(huán)聚合生成mPEG-PCL;由于一級胺是引發(fā)谷氨酸單體聚合最合適的物

7、質(zhì)，因此將mPEG-PCL末端的羥基與氨基端BOC(叔丁氧羰基)保護(hù)的苯丙氨酸通過酯鍵相連，然后水解掉BOC保護(hù)基，露出氨基;以此氨基為引發(fā)劑，與谷氨酸活性單體γ-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(NCA-BLG)發(fā)生聚合，水解掉γ-芐基，得到目標(biāo)聚合物。聚合物的結(jié)構(gòu)通過核磁共振氫譜與傅里葉紅外光譜進(jìn)行驗(yàn)證;表面張力法測定表面張力等溫線，由曲線拐點(diǎn)測出聚合物的臨界聚集濃度為3.6mg/mL，此聚合物可以使水的表面張力降到46mN/m。2％磷

8、鎢酸溶液負(fù)染色透射電子顯微鏡表明溶液中聚集體是形態(tài)比較規(guī)整的球形單層囊泡。
　　2.載藥聚合物囊泡的制備、性質(zhì)及體外釋放行為研究
　　本實(shí)驗(yàn)采用納米沉淀法(nanoprecipitation)制備載藥聚合物囊泡，負(fù)染色法觀察載藥囊泡的形態(tài);并考察不同藥物與聚合物質(zhì)量比對囊泡的載藥量和包封率的影響，根據(jù)囊泡穩(wěn)定性及藥物終濃度選擇藥物/聚合物最適的比例為1.5∶10(w/w)，此時(shí)囊泡的載藥量為（10.4±0.5）％，包封率為（

9、78.7±1.4）％;測得囊泡粒徑大小為(180.9±7.6)nm，zeta電勢為-(38.5±0.3)mV。不同pH條件下的體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，與原料藥溶液相比，囊泡中鹽酸多柔比星的釋放更加緩慢，且在酸性條件下(pH5.0和6.5)較中性條件下藥物的釋放要快，釋放量要高，說明此載藥聚合物囊泡具有pH敏感性。
　　3.載藥聚合物囊泡的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)采用WST-1法研究聚合物材料的毒性，原料藥溶液和載藥囊泡溶液對人乳

10、腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人肺癌細(xì)胞(A549)的細(xì)胞毒性作用。最高濃度聚合物材料(500μg/mL)在各時(shí)間點(diǎn)對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率如下:(25.7±1.5)％(72h)、(17.1±3.4)％(48h)、(12.8±2.7)％(24h)，對A549的抑制率如下:(36.3±1.7)％(72h)、(19.6±3.4)％(48h)、(11.3±2.7)％(24h);各組對細(xì)胞的殺傷力均與濃度和時(shí)間成正相關(guān)性，各濃度載藥囊泡溶液組對兩

11、種細(xì)胞的殺傷力均比原料藥組強(qiáng)，鹽酸多柔比星原料藥溶液對MCF-7的抑制率為（86.7±4.1）％(72h)、(79.9±7.3)％(48h)、(71.2±4.9)％(24h)，而載藥囊泡對MCF-7的抑制率為（93.4±3.4）％(72h)、(89.7±2.3)％(48h)、(79.0±3.4)％(24h);鹽酸多柔比星原料藥溶液對A549的抑制率為（84.2±2.2）％(72h)、（76.5±6.7）％(48h)、(70.2±3.0)

12、％(24h)，載藥囊泡的對A549的抑制率為（86.3±0.9）％(72h)、（84.4±7.2）％(48h)、(75.0±2.5)％(24h)。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明:MCF-7對鹽酸多柔比星原料藥溶液及囊泡溶液的攝取無差別，A549對載藥囊泡的攝取量高于對原料藥的攝取。
　　4.載藥聚合物囊泡的體內(nèi)藥動學(xué)研究
　　本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動物，尾靜脈給藥，沉淀血漿蛋白后，內(nèi)標(biāo)法測定血藥濃度。所測各時(shí)間點(diǎn)藥物濃度數(shù)據(jù)采用D

13、AS2.0軟件處理，以統(tǒng)計(jì)矩原理分析各組藥動數(shù)據(jù)得統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)。注射載藥囊泡大鼠藥動曲線下面積AUC(2081.621)，高于原料藥組(1591.873);且在大鼠體內(nèi)的體內(nèi)平均滯留時(shí)間(MRT)增加了一倍，分別為1.897h(Poly Dox)和0.948(Dox);載藥囊泡與鹽酸多柔比星的表觀分布容積（V）分別為0.015L/kg與0.008L/kg，載藥囊泡的的表觀分布容積提高一倍多;同時(shí)載藥囊泡在藥物體內(nèi)的清除率低于鹽酸多柔比星原