2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒分子流行病學(xué)及HN基因E347K變異對病毒抗原性的影響.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強毒引起的一種烈性傳染病，對全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。NDV屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬，是一種單股、負(fù)鏈有囊膜的RNA病毒。其基因組長度約為15.2Kb，基因組結(jié)構(gòu)模式為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'依次編碼6種蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)、磷蛋白(

2、Phosphate Protein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrix Protein，M)、融合蛋白(Fusion Protein，F(xiàn))、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-NeuraminidaseProtein，HN)和大分子蛋白（Large Polymerase Protein，L）。自上世紀(jì)90年代早期出現(xiàn)以來，基因Ⅶd亞型NDV已經(jīng)成為我國優(yōu)勢流行基因型。研究表明，基因Ⅶd亞型新城疫病毒HN基因E347K變異會增大

3、其與疫苗株的抗原性差異，但這種變異株的流行情況尚不清楚。此外，目前缺乏對活禽市場雞群中弱毒NDV流行情況的數(shù)據(jù)。為此我們對2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒進行分子流行病學(xué)研究，以進一步闡明華東地區(qū)強毒NDV的流行情況，以及活禽市場中弱毒NDV的流行情況。同時，選取自1997-2013年分離自江蘇地區(qū)的基因Ⅶd亞型NDV進行全基因組序列分析，以闡明本地區(qū)基因Ⅶd亞型NDV的進化動力學(xué)。我們還對HN基因在疫苗的保護性中的作用及HN基因

4、E347K變異對病毒抗原性的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)疫苗株與攻擊強毒抗原性匹配程度對疫苗保護作用有很大影響，而HN基因E347K變異是產(chǎn)生抗原性差異的重要原因。
　　1.2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒分子流行病學(xué)研究
　　本研究對2008-2013年從華東地區(qū)分離的新城疫病毒進行遺傳進化分析。從臨床病料中共分離到75株NDV，這些NDV具有不同的宿主來源，主要來自鴨源、鵝源和雞源;從華東地區(qū)活禽市場中共分離到247份ND陽

5、性樣品，分離率為3.48％，其中classⅠ陽性樣品為236份，陽性率為3.32％，獲得classⅠ NDV34株，classⅡ陽性樣品經(jīng)鑒定均為疫苗株LaSota或者V4。2008-2010年在華東地區(qū)臨床樣品中未檢測到強毒NDV，2011-2013年分離到55株基因Ⅶd亞型NDV，這55株基因Ⅶd亞型NDV可以進一步分為Ⅶd1(3/55)和Ⅶd2(52/55)亞型兩個分支，3株基因Ⅶd1亞型分離株均為2011年分離，2012-201

6、3年分離株均屬于Ⅶd2亞型。39/55株基因Ⅶd亞型NDV分離株的F基因發(fā)生K78R變異。對HN基因線性表位及其周圍的氨基酸位點進行分析發(fā)現(xiàn)，38/55株基因Ⅶd亞型NDV發(fā)生E347K變異，并同時發(fā)生G362A變異。此外，疫苗保護試驗結(jié)果表明，LaSota株并不能有效降低排毒率及排毒量。在活禽市場共分離34株classⅠ新城疫病毒，21株為雞源，13株為水禽源，分離株中除了CK/JS/03/09和CK/JS/02/10兩株病毒外，其余

7、的2008-2010分離的毒株均與D/Z J/26/05和D/JS/1/07處于同一個小分支，屬于3b亞型，其余均為3c亞型。我們監(jiān)測結(jié)果表明，華東地區(qū)基因Ⅶd亞型NDVHN基因E347K變異株已成為流行優(yōu)勢;活禽市場classⅠ毒株出現(xiàn)新的3c亞型，而且已經(jīng)發(fā)生由水生禽類向陸生禽類的跨種間傳播，因此有必要對其進行持續(xù)監(jiān)測。
　　2.江蘇地區(qū)基因Ⅶd亞型新城疫病毒進化動力學(xué)研究
　　本研究對從1997-2013年從江蘇地區(qū)分

8、離的25株基因Ⅶd亞型NDV進行全基因組序列分析。根據(jù)6個基因及全基因組核苷酸序列繪制的遺傳進化發(fā)生樹高度一致，分為Ⅶd1和Ⅶd2兩個亞型。通過比對分析發(fā)現(xiàn)，NP基因有3個位點存在差異，其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生T2201變異;P基因有5個位點發(fā)生變異，其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生G320E和R380K變異;M基因有6個位點發(fā)生變化;F基因有5個位點發(fā)生變化，其中2011-2013年分離

9、株與之前的分離株相比發(fā)生K78R變異;HN基因有6個位點發(fā)生變化，其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生E347K和G362A變異;L基因有8個位點發(fā)生變化。使用貝葉斯估算方法對6個基因進行進化速率分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示基因Ⅶd亞型NDV的6個基因的進化速率分別是:NP基因為1.18×10-3;P基因為8.47×10-4;M基因為1.00×10-3;F基因為1.25×10-3; HN基因為1.24×10-3;L基因為1.16×

10、10-3核苷酸替代/位點/年。進化率計算結(jié)果顯示江蘇地區(qū)基因Ⅶd亞型NDV的平均進化速率為1.06×10-3核苷酸替代/位點/年（9.03×10-4～1.25×10-3替代/位點/年），基于拼接的基因組序列BSP分析方法推測基因Ⅶd亞型NDV最早應(yīng)該出現(xiàn)在1991年左右?？傊?，本研究基因?qū)Β鱠亞型NDV的進化規(guī)律進行了揭示。
　　3.HN基因變異對疫苗保護性的影響
　　新城疫疫苗免疫目前是防控NDV的一種重要途徑。F和HN是

11、NDV的兩個表面囊膜糖蛋白，均對病毒的抗原性存在顯著影響。目前，大量研究表明F糖蛋白對疫苗的保護性起主要作用。本研究通過反向遺傳技術(shù)，對HN基因在疫苗保護性中的作用進行研究。本研究通過在基因Ⅶd亞型疫苗候選株AI4骨架上替換流行株JS-16-12-Ch的HN基因，構(gòu)建并拯救新候選疫苗株O/AI4，比較AI4、O/AI4及LaSota株三者用流行株攻擊時保護力差異。將三個疫苗株與JS-16-12-Ch進行交叉中和及交叉血凝抑制試驗，結(jié)果表

12、明AI4株和LaSota株與JS-16-12-Ch株存在顯著抗原性差異，而O/AI4株與JS-16-12-Ch的抗原性差異不顯著。攻毒保護試驗結(jié)果表明，O/AI4免疫組喉頭及泄殖腔排毒率顯著低于AI4及LaSota免疫組。攻毒后3天喉頭棉拭病毒定量結(jié)果表明，O/AI4免疫組顯著低于AI4及LaSota免疫組。對攻毒后3天部分臟器進行病理學(xué)觀察及病毒定量，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，O/AI4免疫組及AI4免疫組病變程度相似，均輕于LaSota免疫組

13、，而O/AI4免疫組胸腺、腎臟和肺的病毒載量顯著低于AI4及LaSota免疫組。我們的研究結(jié)果表明，疫苗株的HN基因?qū)σ呙绲谋Ｗo性具有重要的作用，其與流行株的抗原性匹配程度決定了免疫禽群的排毒率及排毒量。
　　4.HN基因E347K及G362A變異對病毒抗原性影響的研究
　　流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明基因Ⅶd亞型NDV HN基因E347K變異株在華東地區(qū)已經(jīng)成為優(yōu)勢流行株。同時，研究表明HN基因通過某些位點的改變，對病毒抗原性造成

14、顯著影響，進而對疫苗的保護性造成影響。本研究在基因Ⅶd亞型新城疫病毒JS-5-05-Go(I4)骨架上對其HN基因進行E347K單點突變拯救點突變病毒347/I4株，G362A單點突變拯救點突變病毒362/I4株以及E347K、G362A雙點突變拯救點突變病毒347+362/I4株。通過交叉血清學(xué)試驗，對突變后的病毒與母本病毒的抗原性差異進行評價，初步說明這兩個位點對病毒抗原性的影響。我們將I4株的HN基因表達(dá)至雞痘病毒(FPV)中，構(gòu)

15、架重組雞痘病毒rFPV-HN，純化后免疫SPF雞，分別用三個點突變病毒及母本病毒攻毒，對排毒率、排毒量及病理學(xué)變化進行比較，進一步闡釋E347K和G362A變異對病毒抗原性的影響。交叉中和試驗結(jié)果表明兩個347/I4及347+362/I4株與母本病毒I4株的中和試驗R值均為0.38，而362/I4株與I4株的中和試驗R值為0.65，說明347/I4及347+362/I4株與母本病毒I4株存在顯著抗原性差異，而362/I4株則存在較小的抗

16、原性差異。動物試驗結(jié)果表明，347/I4、362/I4及347+362/I4攻毒組泄殖腔排毒率均顯著高于I4攻毒組，對攻毒后3天喉頭排毒進行病毒定量，結(jié)果表明，347/I4、347+362/I4攻毒組排毒量顯著高于I4攻毒組，而362/I4與I4及347/I4與347+362/I4攻毒組不存在顯著性差異。組織病理學(xué)觀察表明，34736/I42組的組織病變重于347/I4組，而362/I4組及I4組的病變最輕。同時，對部分組織臟器的病毒定

17、量結(jié)果與喉頭棉拭定量結(jié)果相一致，347+362/I4組和347/I4組組織病毒載量均顯著高于未突變的I4組，而362/I4組僅在法氏囊與I4株存在顯著性差異，347+362/I4組和347/I4組不存在顯著差異。我們的研究結(jié)果表明，HN基因E347K變異會對病毒抗原性造成顯著性影響，而G362A變異對病毒抗原性影響較為有限，而E347K及G362A雙突變對病毒抗原性影響存在部分協(xié)同作用，會進一步增大抗原性差異，但并未顯著高于E347K變