不同CO-,2-壓力狀態(tài)對卵巢癌SKOV-,3-細(xì)胞增殖、侵襲力影響的實驗研究.pdf

1、近十年，腹腔鏡技術(shù)已經(jīng)取得令人矚目的成就，同時，腹腔鏡惡性腫瘤手術(shù)的安全性問題也越來越受到關(guān)注。臨床上已有腹腔鏡腫瘤外科手術(shù)后穿刺孔和腹膜腫瘤種植率高于開腹手術(shù)、殘余腫瘤生長迅速等病例報道。以二氧化碳(carbondioxide，C02)建立人工氣腹是腹腔鏡與傳統(tǒng)婦科手術(shù)方式的主要病理生理差異。但臨床報道腹腔鏡的相關(guān)并發(fā)癥多與手術(shù)操作失誤有關(guān)，且關(guān)于C02與惡性腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系的細(xì)胞學(xué)及動物實驗報道的結(jié)論并不完全一致，甚至有相悖

2、。本研究擬通過模擬實際腹腔鏡操作環(huán)境，建立不同C02壓力梯度，系統(tǒng)觀察其對卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外、體內(nèi)生長及粘附、轉(zhuǎn)移特性的影響并探討相關(guān)機制，初步評估腹腔鏡C02氣腹用于婦科惡性腫瘤的安全性。 第一部份 不同C02壓力狀態(tài)對卵巢癌SK0V3細(xì)胞體外增殖能力的影響 [目的]通過觀察模擬腹腔鏡實際操作時的不同C02壓力、作用不同時間對卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外生長、增殖能力的影響，評估C02人工氣腹對惡性卵巢腫瘤細(xì)朐體外

3、牛長、增殖的盲接作用并探討相關(guān)機制。 [方法]模擬實際腹腔鏡手術(shù)中的不同CPO壓力操作環(huán)境，建立低(5mmHg)、中(10mmHg)、高(15mmHg)三種不同CO2壓力梯度，分別作用于培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞1h、2h、3h、4h；以未加任何處理的卵巢癌SKOV3細(xì)胞為對照。用全自動生化儀即刻測定C02作用結(jié)束后培養(yǎng)基pH值；采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定繼續(xù)培養(yǎng)4d后的SKOV3腫瘤細(xì)胞生長情況，計算生長抑制率并

4、繪制生長曲線；流式細(xì)胞儀PI染色法測定凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞周期，計算增值指數(shù)及凋亡指數(shù)；軟瓊脂克隆形成試驗對單個細(xì)胞的增殖潛力作定量分析，了解生存環(huán)境改變對細(xì)胞生長能力的影響。 [結(jié)果]隨著C02壓力增高、作用時間延長：①CO2作用3h內(nèi)，各處理組細(xì)胞培養(yǎng)液pH值逐漸降低，并明顯低于對照組(P＜0.01)；但各組作用3h與4h的結(jié)果差異無顯著性(P＞0.05)；②MTT結(jié)果顯示，C02作用3h內(nèi)，處理組SKOV3細(xì)胞OD值逐漸下降

5、，均低于對照組(P＜0.01)，但各組作用3h與4h的結(jié)果差異無顯著性(P＜0.05)；③CO2作用3h內(nèi)，腫瘤細(xì)胞生長抑制率隨壓力增高、作用時間延長而迅速上升，即呈明顯的壓力、時間依賴性，但各組作用3h與4h的結(jié)果差異均無顯著性(P＞0.05)；④腫瘤細(xì)胞生長倍增時間與對照組比明顯延長(P＜0.01)。相關(guān)分析表明，倍增時間與CO2壓力呈正相關(guān)(r=0.74l，P=0.001＜0.01)，但與CO2作用時間并無相關(guān)性(r=0.477，

6、P=0.062＞0.05)；⑤CO2作用3h內(nèi)，處理組SKOV3的G1期細(xì)胞的比例增加，均明顯低于同期的對照組(P＜0.05)。但不同CO2壓力狀態(tài)下各組內(nèi)作用3h與4h的結(jié)果比較，差異均無顯著性(P＞0.05)；⑥處理組SKOV3細(xì)胞生長曲線的幅度明顯變緩，但隨培養(yǎng)時間的延長，其幅度有逐漸恢復(fù)的趨勢。⑦處理組AI值與C02壓力(r=0.71，P=0.002＜0.01)、C02作用時間(r=0.572，P=0.021＜0.05)呈正相關(guān)

7、，但CO2=壓力對AI的影響更為顯著。⑧軟瓊脂克隆形成試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，C02壓力增加、作用時間延長，對SKOV3細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)及細(xì)胞集落的大小并無影響，其差異無著性(P＞0.05)。 [結(jié)論]模擬腹腔鏡操作的三種低、中、高C02壓力狀態(tài)、短期(1h～4h)體外培養(yǎng)SKOV3腫瘤細(xì)胞后，均造成腫瘤細(xì)胞的生存環(huán)境pH下降，導(dǎo)致SKOV3凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，生長停滯于G1期，倍增時間延長，進(jìn)而抑制其生長和增殖，且該抑制

8、效應(yīng)和C02壓力的相關(guān)性明顯大于與作用時間的相關(guān)性。說明C02人工氣腹不會促進(jìn)惡性卵巢腫瘤細(xì)胞體外生長和增殖。 第二部份 不同C012力狀態(tài)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外粘附、侵襲能力的影響 [目的]通過觀察模擬腹腔鏡實際操作時的不同C02壓力及作用時間對卵巢癌SKOV3胞體外粘附、侵襲能力的影響，進(jìn)一步評估C02人工氣腹對惡性腫瘤細(xì)胞SKOV3體外生物學(xué)行為的影響并探討相關(guān)機制。 [方法]模擬實際腹腔鏡操作環(huán)境，建

9、立低(5mmHg)、中(10mmHg)、高(15mmng)三種不同C02壓力梯度，分別作用于培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞lh、2h、3h及4h。以未加任何處理的SKOV3細(xì)胞為對照。采用BoydenChamber侵襲小室、MTT法判斷SKOV3體外粘附、侵襲能力；細(xì)胞免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)判斷與腫瘤轉(zhuǎn)移、粘附密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)蛋白和mRNA表達(dá)情況。

10、 [結(jié)果]隨著CO2壓力增高、作用時間延長：①MTT法測定結(jié)果顯示：與對照組比較，中、低壓力作用4h內(nèi)，OD值差異無顯著性(P＞0.05)；而高C02壓力作用3h，4h后，OD值明顯增加，提示高C02壓力作用較長時間能提高SKOV3細(xì)胞的體外粘附能力(P＜0.01)。②BoydenChamber侵襲小室結(jié)果顯示各組SKOV3細(xì)胞均能夠穿過鋪有Matrigel膠的濾膜。但和對照組相比較，中、低壓力作用4h內(nèi)，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目差異無顯著

11、性(P＞0.05)；而高C032力作用3h，4h后，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.01)。③處理組SKOV3細(xì)胞VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)量有明顯升高的趨勢(p＜0.05)。但相關(guān)性分析表明，VEGF蛋白表達(dá)與C02壓力成正相關(guān)(r=0.735，P=0.001＜0.05)，而與作用時間無關(guān)(r=0.154，P=0.570＞0.05)。④處理組SKOV3細(xì)胞的MMP9蛋白、mRNA表達(dá)量有明顯升高的趨勢(p＜0.05)，并且也與C

12、02壓力成正相關(guān)(r=0.977，P=0.000＜0.05)，而與作用時間無關(guān)。 [結(jié)論]高C02壓力狀態(tài)下(145mmHg)SKOV3細(xì)胞體外侵襲及粘附能力明顯增強，而低、中C02壓力狀態(tài)(5mmHg、10mmHg)對其體外侵襲及粘附能力并無明顯影響。不同的C02壓力狀態(tài)下VEGF及MMP9表達(dá)量均增加，增加程度與C02壓力成正相關(guān)，而與作用時間無關(guān)。低、中C02壓力狀態(tài)(5mmHg、lOmmHg)導(dǎo)致的SKOV3細(xì)胞VEGF

13、及MMP。表達(dá)量雖有增強，但對其體外侵襲及粘附能力并無明顯影響。提示，在低、中C02壓力狀態(tài)下進(jìn)行的腹腔鏡操作，應(yīng)是安全的。 第三部份 不同C02壓力狀態(tài)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤生長的影響及機制探討 [目的]以裸鼠為實驗對象，在排除機體免疫功能對實驗干擾的前提下，進(jìn)一步觀察C02人工氣腹對卵巢癌SKOV3體內(nèi)生長的直接作用并探討相關(guān)的機制。[方法]將60只裸鼠隨機分為4組(每組15只)，將SKOV3細(xì)胞懸液l

14、ml(5×106個)注射入裸鼠左下腹腔，半小時后建立C02氣腹。設(shè)定氣腹壓力分別為3mmHg、8mmHg；作用時間分別設(shè)定為1h，2h。各組分別于氣腹結(jié)束后0h、24h、4w各處死5只動物。觀察術(shù)后4W組各組動物體內(nèi)腫瘤分布范圍、形狀、測定其重量；Western-blot及免疫組織化學(xué)法測定腫瘤組織VEGF及MMP9蛋白表達(dá)情況；TUNNEL法測定腫瘤組織凋亡情況；術(shù)后0h、24h組電鏡觀察腹膜超微結(jié)構(gòu)的變化；Western-blot及

15、RT-PCR測定腹膜tPA和PAI-1蛋白及mRNA表達(dá)變化。 [結(jié)果]隨著C02壓力增高、作用時間延長：①術(shù)后4w，雖然各組腫瘤的性質(zhì)及分布部位無明顯差異，但是隨作用時間的延長，氣腹壓力的增高，總的腫瘤重量明顯增加，各組間差異有顯著性，P＜0.0l；且8mmHg壓力作用lh，2h后腹腔可出現(xiàn)較多、較大的種植性腫瘤包塊，而3mmHg作用1h，2h組的腫瘤體積相對較均一，大體觀明顯小于前者。相關(guān)性分析表明：腫瘤質(zhì)量與C02腹腔壓力

16、呈正相關(guān)(r=0.89，P=0.009＜0.01)，而與作用時間長短無關(guān)(P=0.059＞0.01)。②術(shù)后4w，免疫組織化學(xué)及Western-blot結(jié)果表明，不同C02壓力作用不同時間后，腫瘤組織VEGF、MMP9的蛋白表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。③術(shù)后4W，各組腫瘤組織TUNNEL法染色顯示，腫瘤細(xì)胞的凋亡率差異無顯著性(P＞0.05)。④術(shù)后0h，24h，掃描電鏡檢顯示：隨C02腹腔壓力增加、作用時間延長，裸鼠腹膜超微結(jié)構(gòu)

17、明顯改變，表現(xiàn)為：間皮細(xì)胞間連接增寬、破壞，基底膜暴露甚至斷裂，可見部份間皮細(xì)胞被破壞，甚至暴露腹膜下組織，上述改變在8mmHg持續(xù)2h組，術(shù)后24h最為明顯。⑤術(shù)后0h，24h，Western-blot及RT-PCR顯示：隨C02壓力增加、作用時間延長，腹膜PAI-1、tPA蛋白和mRNA表達(dá)明顯增強。 [結(jié)論]在排外機體免疫反應(yīng)干擾的前提下，C02氣腹有促進(jìn)卵巢腫瘤SKOV3細(xì)胞體內(nèi)生長的作用，且該效應(yīng)隨壓力的增高(宿主腹膜