應用ISSR分子標記對雁鵝遺傳多樣性的研究.pdf

1、雁鵝原產于安徽省六安地區(qū),現主要分布于安徽省宣城市郎溪縣境內,是我國現存的極其珍稀的中型灰鵝品種,已被農業(yè)部列為重點保護的地方品種。 簡單重復序列區(qū)間(Inter-simple sequence repeat, ISSR)標記技術最早是Zietkiewicz(1994)提出的一種簡單重復序列區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記。它是在SSR(Simple sequence repeat, SSR)的基礎上發(fā)展起來的,以PCR技術為基礎,利用真

2、核生物基因組中廣泛存在的SSR來設計引物,無需預先克隆和測序,從而對位于反向排列、間隔不太大的重復序列間的基因組片段進行PCR擴增,擴增的產物經電泳分離獲得多態(tài)性圖譜。該實驗技術成本低,特異性強,實驗穩(wěn)定性較高,所需DNA量少,引物設計比SSR簡單,不需要知道SSR兩端的堿基序列,多態(tài)性高。 本試驗以來自安徽省郎溪縣雁鵝原種鵝場的雁鵝為研究材料,應用ISSR技術對雁鵝種群的譜系和遺傳多樣性進行了探討。本研究的結果將在分子水平上的

3、提供雁鵝種質特性的有關資料,并且可在一定程度上應用于雁鵝保護的實際工作。所得結果如下： (1)建立了雁鵝ISSR-PCR分子標記技術最佳反應體系。以雁鵝基因組DNA為模板,采用正交設計L25(55)對PCR反應中5個因素(引物、dNTPs濃度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶)在5個水平上進行優(yōu)化實驗,在初步實驗的基礎上通過因素內比較進一步優(yōu)化各因素在ISSR-PCR反應中的濃度。在25μL的反應體系中,ISSR引物的濃

4、度為0.20μmol/L,dNTPs濃度為0.28mmol/L,模板DNA的用量為40ng,Mg2+濃度為1.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量為1.0U。擴增程序為94℃變性5min,進行下列35個溫度循環(huán)：94℃變性1min,退火溫度(55℃左右)1min,72℃延伸1min,最后在72℃延伸10min,擴增產物在4℃保存。 (2)對各個引物最佳反應體系確立之后,篩選出43個ISSR引物,對94個供試樣本進行了擴增,

5、共擴增出216個位點,每條引物擴增出的譜帶數在2～7之間,平均為5.0條；各譜帶分子量在150bp～2000bp之間。43條引物擴增出的多態(tài)性條帶共計145條,占總帶數的67.13％,多態(tài)條帶比率在16.67～100％之間,平均為65.60％。 (3)根據ISSR圖譜計算任意兩個個體之間的相似性系數和遺傳距離,構建了由94只個體組成的雁鵝種群的遺傳距離矩陣,并根據該矩陣,用不加權算術平均組對法(Unweighted pair g

6、roup mothed with arithmeticmean, UPGMA)對94個個體間的關系進行聚類分析,由此構建了雁鵝種群的譜系圖。 (4)本研究首次采用ISSR這一核基因DNA標記技術對雁鵝群體遺傳變異進行了分析研究。ISSR-PCR擴增產物在雁鵝種群表現出高度的穩(wěn)定性,并檢測到比RAPD等其它分子標記更多的多態(tài)位點。在整個實驗過程中,也較少出現由于隨機因素造成擴增反應不穩(wěn)定的情況,這充分說明ISSR技術用于分析雁鵝的