2型PUFAs代謝異常與相關(guān)基因多態(tài)性及過(guò)氧化物酶體β-氧化關(guān)系的研究.pdf

1、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，DM)是由于胰島素相對(duì)缺乏或胰島素抵抗(insulin resistance，IR)而引起的代謝紊亂性疾病，可導(dǎo)致多器官功能損害。近年來(lái)，其發(fā)病率逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅人們健康的全球性疾病。因此，深入了解其發(fā)病機(jī)制，對(duì)于2型糖尿病的預(yù)防及治療有著重要意義。
　　脂肪酸代謝紊亂已被公認(rèn)為是2型糖尿病的一個(gè)重要特征，2型糖尿病時(shí)，各種脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸，如何改變？

2、與2型糖尿病的關(guān)系如何？卻研究甚少。
　　相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是從基因水平影響體內(nèi)脂肪酸代謝的重要因素，并且與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，為多不飽和脂肪酸合成過(guò)程中關(guān)鍵酶，△5去飽和酶(△5 desaturase，△5D)和△6去飽和酶(△6 desaturase，△6D)編碼的基因—脂肪酸去飽和酶1(fatty acid desaturas

3、e1，F(xiàn)ADS1)和2(FADS2)基因的SNPs突變與體內(nèi)脂肪酸關(guān)系密切，那么FADS基因簇的SNP突變是否與2型糖尿病時(shí)脂肪酸代謝紊亂有關(guān)？
　　而且，除了基因多態(tài)性能夠影響體內(nèi)脂肪酸代謝以外，體內(nèi)參與脂肪酸代謝的相關(guān)酶的表達(dá)及活性也是影響脂肪酸代謝的重要因素。肝臟是體內(nèi)脂肪酸合成的主要器官，也是為肝外組織提供脂肪酸的主要器官。2型糖尿病時(shí)，肝臟脂肪酸的合成又會(huì)發(fā)生哪些改變？與2型糖尿病時(shí)的脂肪酸代謝紊亂關(guān)系如何？值得進(jìn)一步研

4、究。
　　因此，本研究首先對(duì)2型糖尿病患者血清中脂肪酸譜進(jìn)行檢測(cè)及分析，以了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸變化情況，選出與2型糖尿病關(guān)系密切的脂肪酸作為研究的靶點(diǎn)，從基因水平以及肝臟對(duì)脂肪酸合成影響角度深入探討2型糖尿病時(shí)脂肪酸代謝紊亂的機(jī)制，為2型糖尿病的預(yù)防和治療提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　第一部分、2型糖尿病患者血清脂肪酸譜分析
　　目的:了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸代謝改變情況，為研究2型糖尿病時(shí)脂肪酸代謝紊亂機(jī)制尋

5、找靶點(diǎn)。
　　方法:選擇符合條件的研究對(duì)象共752例，按照病例對(duì)照研究分組（健康人421例，2型糖尿病患者331例），收集空腹血清，測(cè)定空腹血糖(fastingblood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INs）、甘油三酯(triglycerides，TGs)、膽固醇(total cholesterol，TC)及總游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)，計(jì)算體重指數(shù)（body

6、mass index，BMI）;用高效氣相色譜法測(cè)定所有受試者空腹血清中主要的14種脂肪酸，并進(jìn)行分類分析，以了解2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪酸代謝情況。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況及生化指標(biāo)2型糖尿?。―M組）與健康非糖尿病組（Con組）的性別比例一致，沒(méi)有差異。與Con組相比，DM組的年齡64(10) vs.51.38(18)，明顯高于Con組，P＜0.001; DM組的BMI(25.568±3.316 vs.23.177±

7、2.434)同樣明顯增加，P＜0.001。
　　與Con組相比，DM組FBG、FINs、TC及TGs均明顯增高，P＜0.001;通過(guò)公式計(jì)算得DM組的胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)明顯下降，而胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)則明顯增加，P＜0.001。血清總FFAs明顯增加，（403.39±82.54μmol/L vs.658.62±125.75μmol/L），P＜0.001。
　　

8、2.血清脂肪酸譜脂肪酸譜顯示:與Con相比，DM組血清中C16∶0、C16∶1n-7、C18∶1n-9、C18∶3n-3(α-linolenic acid, ALA)、C20∶5n-3(eicosapentaenoic acid, EPA)、C22∶5n-3(docosapentaenoic acid, DPA)及C20∶4n-6(arachidonic acid, AA)百分含量明顯增加，P＜0.01;C18∶0、C24∶0、 C22

9、∶6n-3(docosahexenoic acid,DHA)和C18∶2n-6(linoleic acid, LA)的百分含量明顯下降，P＜0.01;只有C20∶0、C22∶0和C22∶4n-6變化不明顯。
　　對(duì)各種脂肪酸進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn):與Con組相比，DM組的總單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFAs)所占比例明顯升高，P＜0.01;而總飽和脂肪酸（saturated fatty

10、acid, SFAs），總n-3系多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，n-3PUFAs)和總n-6系多不飽和脂肪酸(n-6PUFAs)均沒(méi)有明顯變化。
　　小結(jié):
　　1.2型糖尿病患者體內(nèi)總游離脂肪酸增加。
　　2.2型糖尿病患者血清脂肪酸譜發(fā)生明顯改變，AA含量明顯增加，DHA的含量明顯下降。
　　第二部分、FASDS1-FADS2基因簇單核苷酸多態(tài)性與血清PUFAs、去飽

11、和酶活性及2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究
　　目的:探討FADS1-FADS2基因簇的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)與2型糖尿病患者血清PUFAs及2型糖尿病之間的相關(guān)性。
　　方法:選擇符合條件的研究對(duì)象752例（入選和排除標(biāo)準(zhǔn)同第一部分研究），收集外周血，提取DNA，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption/ioni

12、zation Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)進(jìn)行DNA的SNPs分型。用非條件Logistic回歸逐一分別在未校正混雜因素;校正性別和年齡;校正性別、年齡和BMI時(shí)，分析rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四個(gè)SNP位點(diǎn)與2型糖尿病患者血清PUFAs、去飽和酶活性以及2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.按照基

13、因型分析血清PUFAs的含量及去飽和酶活性
　　1.1 rs174545位點(diǎn)突變對(duì)血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174545(C＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體血清LA的相對(duì)含量增加，AA的含量相對(duì)降低;在2型糖尿病患者中，rs174545(C＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體不僅血清LA相對(duì)含量增加，AA相對(duì)含量降低,還出現(xiàn)了EPA與DPA相對(duì)含量的下降(P＜0.05)。另外，rs174545(C＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型

14、還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降(P＜0.05)。
　　1.2 rs2072114位點(diǎn)突變對(duì)血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs2072114(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體血清AA的含量相對(duì)降低;在2型糖尿病患者中，rs2072114(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體不僅血清LA相對(duì)含量增加，AA相對(duì)含量降低，還出現(xiàn)了EPA與DPA相對(duì)含量的下降(P＜0.05)。另外，rs20

15、72114(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降（P＜0.05）。
　　1.3 rs174602位點(diǎn)突變對(duì)血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174602(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體血清LA的含量相對(duì)增加，AA和EPA的含量相對(duì)降低;在2型糖尿病患者中，rs174602(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型的個(gè)體不僅血清LA相對(duì)含量增加，AA相對(duì)含量降低，還出現(xiàn)了D

16、PA相對(duì)含量的下降（P＜0.05）。另外，rs174602(A＞G)位點(diǎn)攜帶G基因型還可以使健康人血清中AA/LA和EPA/ALA，及2型糖尿病患者組血清中EPA/ALA比值下降(P＜0.05)。
　　1.4 rs174616位點(diǎn)突變對(duì)血清PUFAs及去飽和酶活性的影響在健康人中，rs174616(C＞T)位點(diǎn)攜帶T基因型的個(gè)體血清AA含量相對(duì)降低，對(duì)其他PUFAs沒(méi)有影響;在2型糖尿病患者中，rs174616(C＞T)位點(diǎn)攜帶T

17、基因型的個(gè)體血清LA相對(duì)含量增加(P＜0.05)，對(duì)其他PUFAs也沒(méi)有影響。另外，rs174616(C＞T)位點(diǎn)攜帶T基因型還可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA的比值下降(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果說(shuō)明:rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616均可以影響健康人和2型糖尿病患者體內(nèi)的PUFAs含量與AA/LA和（或）EPA/ALA的比值，其中rs174616只對(duì)n-6系PUFAs的代謝

18、有影響。另外，同一種突變因素在健康人和2型糖尿病體內(nèi)引起的表現(xiàn)不同。
　　2.FADS1-FADS2基因簇的SNP突變與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究
　　2.1 Logistic回歸分析（未剔除混雜因素）
　　結(jié)果顯示:rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在著負(fù)相關(guān)。在共顯性模型下，與攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體比較，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個(gè)體發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低

19、，OR值分別為0.708(95％CI=0.508,0.987, P=0.041)和0.720(95％CI=0.521,0.985,P=0.043);在顯性模型下，與攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體比較，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低，OR值為0.717（95％CI=0.518，0.992，P=0.042）;而在隱性模型下，與攜帶rs174616(CC+CT)基因型的個(gè)體比較，攜帶rs17461

20、6TT基因型的個(gè)體發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有變化。
　　rs174545，rs2072114和rs174602，與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。以健康者為對(duì)照組，以2型糖尿病為病例組，在3種模型下差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 調(diào)整性別與年齡（調(diào)整1）
　　結(jié)果顯示:在調(diào)整性別與年齡之后，rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)生率仍成負(fù)相關(guān)。在共顯性模型下，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個(gè)體比攜帶r

21、s174616CC基因型的個(gè)體，發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低，OR值為0.628(95％CI=0.437,0.901,P=0.011)和0.619(95％CI=0.441,0.889，P=0.010);在顯性模型下，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體比攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低，OR值為0.630(95％CI=0.442，0.897，P=0.01);在隱性模型下，rs174616的基因型與2型糖

22、尿病發(fā)病仍然無(wú)關(guān)。
　　調(diào)整性別與年齡后，其他3個(gè)位點(diǎn):rs174545，rs2072114和rs174602仍與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。
　　2.3 調(diào)整性別、年齡和BMI（調(diào)整2）
　　結(jié)果顯示:在調(diào)整性別、年齡與BMI之后，rs174616C＞T與2型糖尿病的發(fā)生率仍成負(fù)相關(guān)。在共顯性模型下，攜帶rs174616CT和rs174616TT基因型的個(gè)體比攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體，發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降

23、低，OR值為0.656(95％CI=0.447，0.964，P=0.032)和0.652(95％CI=0.440，0.931，P=0.020);在顯性模型下，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體比攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低，OR值為0.646（95％CI=0.443，0.943，P=-0.023）;在隱性模型下，rs174616的基因型與2型糖尿病發(fā)病仍然無(wú)關(guān)。
　　調(diào)整性別、年齡和BM

24、I后，其他3個(gè)位點(diǎn):rs174545，rs2072114和rs174602仍與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，在排除了性別、年齡和BMI的干擾后，攜帶突變型基因rs174616(CT+TT)的個(gè)體比攜帶野生型基因rs174616CC的個(gè)體，發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下降，即該位點(diǎn)的突變是2型糖尿病發(fā)病的保護(hù)因素。而rs174545，rs2072114和rs174602三個(gè)位點(diǎn)的突變則與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。
　　

25、3.按照顯性模型分析rs174616位點(diǎn)SNP突變對(duì)血清PUFAs及去飽和酶活性的影響為了進(jìn)一步探討rs174616與2型糖尿病患者血清PUFAs代謝的關(guān)系，接下來(lái)我們按照rs174616CC和rs174616(CT+TT)基因型分別對(duì)健康非糖尿病患者和2型糖尿病患者血清PUFAs含量，以及AA/LA和EPA/ALA的比值進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:在健康人，攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體比攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體

26、AA/LA的比值下降;在2型糖尿病患者中。攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體比攜帶rs174616CC基因型的個(gè)體LA含量增加，AA/LA比值下降。另外，rs174616位點(diǎn)突變對(duì)n-3系PUFAs及EPA/ALA均沒(méi)有影響。
　　小結(jié):
　　1.在中國(guó)北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇中rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四個(gè)突變位點(diǎn)都能降低健康人和2型糖尿病患者△

27、5D和△6D的活性，從而影響血清中LA、AA和EPA的含量，而對(duì)ALA和DHA的含量沒(méi)有影響。
　　2.在中國(guó)北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇中rs174616位點(diǎn)突變與2型糖尿病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，即攜帶rs174616(CT+TT)基因型的個(gè)體2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯下降，可能與rs174616(CT+TT)基因型能夠降低體內(nèi)AA的合成有關(guān)。
　　第三部分、過(guò)氧化物酶體β-氧化活性增強(qiáng)與2型糖尿病大鼠肝臟DHA合

28、成增加有關(guān)
　　目的:從肝臟合成脂肪酸角度探討2型糖尿病時(shí)DHA變化的機(jī)制。
　　方法:用高脂飲食加小劑量鏈脲左菌素(streptozotocin，STZ)的方法誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，檢測(cè)2、型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸譜;△5去飽和酶(△5-desaturase，△5D)和△6去飽和酶(△6D)表達(dá)水平;過(guò)氧化物酶體β氧化活性和相關(guān)酶的表達(dá)及DHA合成活性等方面去研究肝臟DHA合成情況，為尋找2型糖尿病時(shí)體內(nèi)DHA改變的原因提

29、供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.2型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸譜由于食用的是高脂飲食，與Con組大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝臟中C18∶0和C18∶1n-9（高脂飲食中主要的脂肪酸）明顯增加;SFAs/PUFAs的比值增高，而長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸C24∶0則明顯降低。另外，與Con組大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝臟中絕大多數(shù)的PUFAs(ALA、LA、AA、EPA和DPA)和總PUFAs都明顯下降，但是我們卻意外的發(fā)現(xiàn)DHA和C22∶4n-

30、6明顯增加，幾乎是Con組的2倍;而且2型糖尿病大鼠肝臟DHA/ALA的比值也增加了，大約是Con組的5倍。因此，以上結(jié)果提示，2型糖尿病大鼠肝臟DHA的含量增加，增加的DHA可能是由于在合成增加引起的。
　　2.2型糖尿病大鼠肝臟DHA合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的表達(dá)為了進(jìn)一步研究2型糖尿病大鼠肝臟DHA增多與DHA合成代謝的關(guān)系，我們檢測(cè)了DHA合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的表達(dá)，結(jié)果顯示:與Con組相比，2型糖尿病大鼠肝臟△5D和△6D的mRNA

31、和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降，而過(guò)氧化物酶體β氧化過(guò)程中的酶直鏈脂酰CoA氧化酶(straight-chainacyl-CoA oxidase，SCOX)、D雙功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)和3-酮脂酰CoA硫解酶（3-Ketoacyl-CoA thiolase，THL）的表達(dá)增加。由此推斷，2型糖尿病大鼠肝臟DHA增多是由于過(guò)氧化物酶體階段β氧化增強(qiáng)引起的，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)階段的去飽和、延長(zhǎng)反應(yīng)無(wú)關(guān)。
　　

32、3.2型糖尿病大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體β氧化階段DHA合成活性為了證實(shí)過(guò)氧化物酶體β氧化階段與2型糖尿病時(shí)肝臟DHA合成增多有關(guān)，首先，我們對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體β氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示過(guò)氧化物酶體β氧化活性增加。這一結(jié)果與此過(guò)程中的酶表達(dá)增加相符，也與前面的結(jié)果中提到2型糖尿病大鼠肝臟C24∶0含量下降一致，因?yàn)闃O長(zhǎng)鏈脂肪酸C24∶0在體內(nèi)只能夠通過(guò)過(guò)氧化物酶體被氧化代謝。
　　接下來(lái)，我們用C24∶6n-3作為底物

33、,與肝組織勻漿共孵育，直接檢測(cè)過(guò)氧化物酶體β氧化階段DHA的合成。結(jié)果顯示:C24∶6n-3與肝組織勻漿共孵育4小時(shí)后，2型糖尿病大鼠肝臟增加的DHA和減少的C24∶6n-3均比對(duì)照組變化明顯。由此可見(jiàn)，2型糖尿病大鼠肝臟過(guò)氧化物酶體β氧化活性增加與DHA合成增強(qiáng)有關(guān)。
　　小結(jié):
　　1.高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠肝臟絕大多數(shù)PUFAs明顯減少，而只有DHA含量增加。
　　2.2型糖尿病大鼠肝臟DHA

34、增加，增多的DHA與過(guò)氧化物酶體β氧化活性增強(qiáng)有關(guān)，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)△5和△6去飽和酶的表達(dá)下降無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.2型糖尿病患者不僅存在血清總游離脂肪酸的增多，而且血清脂肪酸譜也發(fā)生了明顯變化，n-3系PUFAs中DHA的含量明顯下降;n-6系PUFAs中AA的含量明顯增加，LA的含量則明顯降低。
　　2.在中國(guó)北方漢族人群中，F(xiàn)ADS1-FADS2基因簇的rs174616(C＞T)位點(diǎn)SNP突變與2型糖尿病的發(fā)病