SNAP-tag重組表達與過氧化物酶體熒光標記研究.pdf

1、細胞內活性物質的分布、變化及相互作用的探究，對于了解細胞內復雜多變的生理生化過程具有十分重要的意義。熒光技術的不斷發(fā)展，為探究細胞內復雜多變的過程提供了技術手段。過氧化物酶體作為真核細胞中一種重要的細胞器，尚缺乏能夠準確定位其中的熒光探針用以研究其功能。近年來，蛋白質特異性標記技術結合了熒光蛋白和小分子熒光探針的優(yōu)勢被開發(fā)應用，SNAP-tag憑借對靶蛋白標記所具有的高特異性和穩(wěn)定性以及配體功能的多樣性等獨特優(yōu)勢在眾多靶向標記技術中脫穎

2、而出。本文以SNAP-tag蛋白標記技術為基礎，利用新型熒光底物對過氧化物酶體進行標記，并同時對NO進行實時監(jiān)測，為定位監(jiān)測小分子活性物質在細胞內的分布、變化及功能的探究提供技術手段?；诖耍菊撐闹饕隽艘韵鹿ぷ?
　　(1)采用基因工程方法，構建原核表達載體pET28a-SNAP，通過原核表達純化獲得SNAP-tag蛋白（約27kD），濃度為2.14 mg·mL-1。利用新型熒光底物TMR-BG、BDP-BG標記SNAP-ta

3、g蛋白，光譜結果顯示，與對照組（使用BSA蛋白）相比，加入SNAP-tag蛋白的實驗組熒光顯著增強，且熒光強度隨時間的延長而不斷增強直至平衡。證明新型熒光底物與SNAP-tag蛋白可以實現(xiàn)高效、特異性的結合，為后續(xù)細胞內標記實驗的可行性奠定基礎。
　　(2)構建pSNAP-PTS1/pCLIP-PTS1真核表達載體。穩(wěn)定轉染至COS-7細胞中，實現(xiàn)SNAP-tag及CLIP-tag蛋白在過氧化物酶體中的表達。TMR-BG、BDP-

4、BG對SNAP-tag的標記結果及BDP-V-BC對CLIP-tag的標記結果顯示，三種熒光底物均能對相應細胞內的特定位點進行熒光標記，標記的位置呈現(xiàn)球形或橢圓形分布于細胞質中，而不含有PTS1信號肽的pSNAP/pCLIP呈現(xiàn)整個細胞的分散標記。初步判斷實現(xiàn)了對細胞內過氧化物酶體的標記。構建pEGFP-PTS1真核表達載體，瞬時轉染至穩(wěn)定表達SNAP-PTS1的細胞中，與TMR-BG熒光底物的共成像結果顯示重疊效果良好，驗證pSNAP