SNAP-tag重組表達(dá)與過氧化物酶體熒光標(biāo)記研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的分布、變化及相互作用的探究，對于了解細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜多變的生理生化過程具有十分重要的意義。熒光技術(shù)的不斷發(fā)展，為探究細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜多變的過程提供了技術(shù)手段。過氧化物酶體作為真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，尚缺乏能夠準(zhǔn)確定位其中的熒光探針用以研究其功能。近年來，蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了熒光蛋白和小分子熒光探針的優(yōu)勢被開發(fā)應(yīng)用，SNAP-tag憑借對靶蛋白標(biāo)記所具有的高特異性和穩(wěn)定性以及配體功能的多樣性等獨特優(yōu)勢在眾多靶向標(biāo)記技術(shù)中脫穎

2、而出。本文以SNAP-tag蛋白標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，利用新型熒光底物對過氧化物酶體進(jìn)行標(biāo)記，并同時對NO進(jìn)行實時監(jiān)測，為定位監(jiān)測小分子活性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布、變化及功能的探究提供技術(shù)手段?；诖耍菊撐闹饕隽艘韵鹿ぷ?
　　(1)采用基因工程方法，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-SNAP，通過原核表達(dá)純化獲得SNAP-tag蛋白（約27kD），濃度為2.14 mg·mL-1。利用新型熒光底物TMR-BG、BDP-BG標(biāo)記SNAP-ta

3、g蛋白，光譜結(jié)果顯示，與對照組（使用BSA蛋白）相比，加入SNAP-tag蛋白的實驗組熒光顯著增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度隨時間的延長而不斷增強(qiáng)直至平衡。證明新型熒光底物與SNAP-tag蛋白可以實現(xiàn)高效、特異性的結(jié)合，為后續(xù)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記實驗的可行性奠定基礎(chǔ)。
　　(2)構(gòu)建pSNAP-PTS1/pCLIP-PTS1真核表達(dá)載體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中，實現(xiàn)SNAP-tag及CLIP-tag蛋白在過氧化物酶體中的表達(dá)。TMR-BG、BDP-

4、BG對SNAP-tag的標(biāo)記結(jié)果及BDP-V-BC對CLIP-tag的標(biāo)記結(jié)果顯示，三種熒光底物均能對相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的特定位點進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記的位置呈現(xiàn)球形或橢圓形分布于細(xì)胞質(zhì)中，而不含有PTS1信號肽的pSNAP/pCLIP呈現(xiàn)整個細(xì)胞的分散標(biāo)記。初步判斷實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體的標(biāo)記。構(gòu)建pEGFP-PTS1真核表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)SNAP-PTS1的細(xì)胞中，與TMR-BG熒光底物的共成像結(jié)果顯示重疊效果良好，驗證pSNAP