重組人過氧化物酶體增殖物激活受體γ——胰高血糖素樣肽-1的克隆、表達及純化.pdf

1、背景:過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)屬于核受體超家族中PPARs家族成員，為配體依賴性轉錄因子。PPARγ配體包括天然型配體和合成型配體，其中合成型配體噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)類藥物可選擇性的與PPARγ結合，TZD類藥物能夠增加骨骼肌中葡萄糖的利用，并降低體內肝臟的葡萄糖合成。有研究表明，PPARγ功能受損會導致嚴重的胰島素抵抗。
　　 胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是胰島α細胞

2、和腸黏膜L細胞分泌的一種激素，含有30個氨基酸，經胰高糖素原加工，其N端形成胰高糖素，C端形成GLP-1和GLP-2。GLP-1的活性形式是GLP-1(7-36)，可以促進葡萄糖依賴性的胰島素分泌、減少食物的攝取、減慢胃的排空、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰島β細胞增殖，促進胰島再生，又能抑制胰島β細胞的凋亡。目前已有研究證明PPARγ和GLP-1在糖尿病治療中的作用，然而有無既可恢復胰島素敏感性又能促進胰島β細胞增殖藥物的研究，尚未

3、見有關報道。
　　 目的:本實驗構建含人過氧化物酶體增殖物激活受體γ-胰高血糖素樣肽-1的原核表達載體(pET32a-PPARγ-GLP-1)，通過原核表達系統(tǒng)，獲得大量融合蛋白，為進一步檢測其生物活性提供研究基礎。
　　 方法:從人脂肪中提取總RNA通過RT-PCR方法擴增出人PPARγ基因序列，從人外周血有核細胞中提取人類基因組DNA，PCR擴增獲得GLP-1基因序列，通過基因重組技術構建pET32a-PPARγ-G

4、LP-1，經雙酶切及測序鑒定陽性克隆;轉化入Rosseta(DE3)感受態(tài)細胞中，用IPTG誘導表達，表達產物經10％SDS-PAGE凝膠電泳，并做Western boltting鑒定。融合蛋白經鎳離子層析純化。
　　 結果:1.成功構建pET32a-PPARγ-GLP-1表達載體，經雙酶切及測序鑒定。2.10％SDS-PAGE結果表明，目的基因在大腸桿菌Rosseta(DE3)中以包涵體形式表達，相對分子量(Mr)73kDa。

5、3.經誘導表達條件優(yōu)化，在37℃，誘導劑IPTG濃度為1mmol/L，誘導10h，可獲得大量PPARγ-GLP-1融合蛋白。4.經Ni-NTA純化獲得較高濃度融合蛋白。5.Western blotting顯示目的蛋白能被anti-his標簽抗體識別，再次證實目的蛋白成功表達。
　　 結論:本研究證實可以成功構建pET32a-PPARγ-GLP-1重組質粒，且目的基因可在大腸桿菌Rosseta(DE3)原核表達系統(tǒng)中以包涵體形式高