模擬微重力狀態(tài)下過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達(dá)對(duì)成骨分化的影響.pdf

1、背景：
　　 微重力又稱(chēng)零重力，是相對(duì)于地球表面1g重力環(huán)境而言的一種“零重量”狀態(tài)，也是人類(lèi)在太空工作及生活所處的環(huán)境。人類(lèi)長(zhǎng)時(shí)間處于微重力狀態(tài)下可引起各種病理生理變化，其中包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫功能下降等，而骨質(zhì)疏松癥是其中最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。據(jù)報(bào)道，空間飛行中平均每月出現(xiàn)2％的骨丟失，相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女1年的骨丟失，且返回地面后骨丟失持續(xù)存在，這嚴(yán)重影響到飛行員健康。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有研究認(rèn)為，微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥主

2、要發(fā)病機(jī)制是空間飛行導(dǎo)致成骨細(xì)胞(OB)形狀及結(jié)構(gòu)明顯改變，細(xì)胞多呈現(xiàn)濃縮核或核分散，由于重力作用而導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化引起骨吸收增加，成骨細(xì)胞完整性及礦化結(jié)節(jié)形成功能缺失?，F(xiàn)有的藥物、物理治療未能起到理想的治療效果，極大地限制了今后的航天載人事業(yè)發(fā)展及人類(lèi)長(zhǎng)期在太空工作、生活。為探求其他防治失重性骨質(zhì)疏松的方法，模擬微重力下骨代謝及細(xì)胞信號(hào)通路的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一。
　　 1990年Issemann[2]

3、等首先發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)能被脂肪酸樣化合物過(guò)氧化物酶體增殖劑(peroxisome proliferators，PP)激活，而被命名為PP激活受體(peroxisomeprolifemtor-activated receptor，PPAR)。PPAR是一類(lèi)廣泛參與糖脂調(diào)節(jié)、脂肪儲(chǔ)存基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員。在兩棲類(lèi)、嚙齒類(lèi)及人類(lèi)PPARs由于基因的啟動(dòng)子和拼接方式不同均存在3種亞型，即PPAR a、PPARβ（亦稱(chēng)PPARδ或

4、NUC-1）和PPARγ。PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織，在胰島B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞也有表達(dá)，已被公認(rèn)在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化與糖、脂肪及能量等多種代謝中起重要作用，其基因位于染色體3p25。PPARγmRNA含有9個(gè)外顯子，基因組DNA全長(zhǎng)約100 kb，存在著4種異構(gòu)體即PPARγ-1、PPARγ-2、PPARγ-3和PPARγ-4。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）還與激活蛋白21(AP21)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與

5、轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)、Fos蛋白家族成員δFosB蛋白、細(xì)胞周期素D等因子及Wnt信號(hào)通路協(xié)同作用調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和凋亡，其中包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化過(guò)程。PPARγ信號(hào)通路可通過(guò)激活或關(guān)閉下游信號(hào)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化方向，即增加或減少干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞數(shù)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[3-5]。
　　

6、 噻唑烷二酮類(lèi)藥物作為PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路的人工合成受體，在極低劑量下（毫微克分子）即可激活PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路。吡格列酮作為噻唑烷二酮類(lèi)藥物代表之一，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于糖尿病治療，選取其作為實(shí)驗(yàn)用PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路激動(dòng)劑，更具有臨床意義。GW9662是PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路常用的抑制劑，其效果被國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所肯定而廣泛應(yīng)用于抑制PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路。
　　 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合于微載體上，在模擬微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系

7、統(tǒng)(RCCS)中進(jìn)行向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)，通過(guò)激活及抑制PPARγ通路，檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化過(guò)程中所受的影響。期望本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為骨質(zhì)疏松癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)一步積累科學(xué)依據(jù)及提供可能的新治療方向。
　　 目的：
　　 觀察過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ細(xì)胞通路在體外模擬微重力狀態(tài)下對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響及吡格列酮、GW9662對(duì)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達(dá)的影響。
　　 對(duì)象和方法：<

8、br>　　 1.BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增:取材5周齡SD大鼠股骨及脛骨骨髓作BMSCs原代培養(yǎng)，沖出的骨髓細(xì)胞懸液裝入預(yù)先準(zhǔn)備的15ml離心管，室溫下以1000r/min離心5min，棄上清、脂肪及雜質(zhì)，F(xiàn)12/DMEM重懸，洗滌細(xì)胞;用含有10％胎牛血清的DMEM/F12重懸細(xì)胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液(10％FCS、青霉素G100U/ml，鏈霉素100U/ml的DMM/F12培養(yǎng)基)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱

9、中培養(yǎng)。依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第4-5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象。
　　 2.BMSCs性質(zhì)鑒定:采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞表面CD29、CD34、CD44分子表達(dá)并繪制成流式圖。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為:正常重力組(NG)、模擬微重力組(MG)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮組(MG+PIO)、模擬微重力+10μmol/LGW9662組(MG+GW)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮+

10、10μmol/L GW9662組(MG+PIO+GW)。正常重力組在正常重力下以貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)14d，模擬微重力組和模擬微重力+吡格列酮和（或）GW9662組均在旋轉(zhuǎn)式重力反應(yīng)器中模擬微重力培養(yǎng)14d。細(xì)胞培養(yǎng)14d后，實(shí)驗(yàn)組均用2ml0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液在37℃下消化1-2min，離心收集OB進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4.觀察各組14d后使用茜素紅染色檢測(cè)成骨結(jié)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測(cè)、油紅-O染色檢測(cè)脂肪細(xì)

11、胞及計(jì)算成脂率、兩步法RT-PCR（半定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)PPARγ基因的mRNA表達(dá)情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S）表示，多組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，描述性統(tǒng)計(jì)分析單因素方差分析(One Way) ANOVA及LSD方法進(jìn)行多樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊性采用Levene檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

12、r>　　 1.BMSCs生長(zhǎng)情況:原代大鼠BMSCs接種后，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈圓型。24小時(shí)換液后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)3d，可觀察到成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落，細(xì)胞伸出長(zhǎng)短不一，粗細(xì)不均的突起，胞漿豐富，胞核大，核仁清晰，每隔兩天在無(wú)菌條件下進(jìn)行全量換液以祛除雜質(zhì)。7至9d后細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，呈同向旋渦狀排列。10至12d后細(xì)胞排列緊密，逐漸融合成片。進(jìn)行細(xì)胞傳代純化培養(yǎng)，每隔3至4d科傳代一次，連續(xù)傳代4-5代后，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)均一，呈梭

13、形生長(zhǎng)，胞漿豐富，細(xì)胞核明顯，每個(gè)細(xì)胞有一兩個(gè)核仁。
　　 2.BMSCs性質(zhì)鑒定:采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD分子表達(dá)，結(jié)果顯示CD29(99.52％)、CD34(0.58％)、、CD44(41.88％)，鑒定結(jié)果顯示出間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，CD34間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陰性，而CD29、CD44間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陽(yáng)性。以上結(jié)果與李曉峰[6]等結(jié)果一致，可證實(shí)其為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。同時(shí)將BMSCs加入成骨細(xì)

14、胞分化誘導(dǎo)液，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化鑒定。
　　 3.成骨細(xì)胞的鑒定:經(jīng)成骨誘導(dǎo)液連續(xù)分化培養(yǎng)14d后，茜素紅染色后在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)紅色或褐色礦化結(jié)節(jié)。模擬微重力組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較正常重力組減少，模擬微重力+吡格列酮組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較微重力組明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，模擬微重力+GW9662組視野內(nèi)可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組輕微增多，模擬微重力+吡格列酮+GW9662組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組增加，與模擬微重力+GW9662

15、組相比減少。
　　 4.堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè):與正常重力組相比，模擬微重力培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，模擬微重力培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組別堿性磷酸酶活性降低。與模擬微重力組相比，模擬微重力+吡格列酮組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，模擬微重力+GW9662組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力+GW9662組

16、及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5.脂肪細(xì)胞的鑒定及成脂率計(jì)算:與正常重力組相比，模擬微重力培養(yǎng)的細(xì)胞中脂肪細(xì)胞數(shù)量及成脂率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，模擬微重力培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組別成脂率升高。與模擬微重力組相比，模擬微重力+吡格列酮組及模擬微重力+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模擬微重力+吡格列酮組成脂率升高，模擬微重力+GW9

17、662組的成脂率降低。與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力+GW9662組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，均低于模擬微重力+吡格列酮組。
　　 6.OB的PPARγ的mRNA的表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示:與正常重力組相比，模擬微重力組及模擬微重力+吡格列酮組PPARγ的mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力組、模擬微重力+

18、吡格列酮組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組PPARγ的mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.“全骨髓貼壁培養(yǎng)法”培養(yǎng)原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種科學(xué)有效、簡(jiǎn)單可靠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增方法。
　　 2.體外模擬微重力培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，降低成骨分化率，并增加干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化幾率，打破成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間平衡，使骨基質(zhì)形成、

19、成熟和礦化作用降低，上調(diào)了PPARγ基因的mRNA表達(dá)。
　　 3.吡格列酮可以進(jìn)一步減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，加重骨基質(zhì)形成、成熟和礦化的障礙，并上調(diào)PPARγ基因的mRNA表達(dá)。
　　 4.GW9662可以部分逆轉(zhuǎn)模擬微重力狀態(tài)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的抑制作用，抑制脂肪細(xì)胞生成，下調(diào)PPARγ基因的mRNA表達(dá)。
　　 5.PPARγ細(xì)胞信號(hào)通路的激活可能是造成模