過氧化物酶體增殖物活化受體γ基因靜默對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：⑴探討過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。⑵構(gòu)建靶向過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARrγ）基因的shRNA—DNA表達(dá)載體，觀察體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HCCLM3細(xì)胞后，其對(duì)PPARγ活性的抑制效率。⑶體外和活體內(nèi)觀察pshPPARγ抑制PPARγ活性對(duì)HCCLM3細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討可能的作用機(jī)制。⑷觀察pshPPARγ抑制PPARγ活性對(duì)HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)移和移植瘤瘤內(nèi)微循環(huán)的影響，

2、并探討可能作用機(jī)制。 方法：①半定量RT—PCR及Western blot法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HepG2、HepG2.2.15、HCCLM3、肝細(xì)胞株L—02和34例手術(shù)切除的肝癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織PPARγ mRNA、蛋白表達(dá)，應(yīng)用CD34染色和CD34聯(lián)合過碘酸雪夫氏反應(yīng)（PAS）復(fù)合染色檢測(cè)微血管密度（MVD）和血管生成擬態(tài)（VM），結(jié)合細(xì)胞株生物學(xué)特性及患者臨床特征探討PPARγ表達(dá)的臨床意義。②以人PPAR

3、γ1為靶基因設(shè)計(jì)并合成兩條DNA序列，克隆到載體pBAsi—hU6—DNA中構(gòu)建重組體pshPPARγ，無內(nèi)毒素抽提，并測(cè)序鑒定。DOTAP脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組體至HCCLM3細(xì)胞，優(yōu)化G418濃度、篩選，以裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為陽性對(duì)照，正常培養(yǎng)細(xì)胞為陰性對(duì)照，半定量RT—PCR及Western blot觀察轉(zhuǎn)染40h、篩選的陽性克隆細(xì)胞中PPARγ表達(dá)變化。③應(yīng)用pshPPARγ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長曲線，TUNEL法觀

4、察凋亡細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀分析凋亡率；應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)pshPPARγ的HCCLM3細(xì)胞建立裸鼠動(dòng)物模型，觀察腫瘤生長狀況，應(yīng)用TUNEL法觀察移植瘤腫瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HCCLM3細(xì)胞和移植瘤PCNA、wt—P53和整合素β1變化，RT—PCR檢測(cè)MMP2、TIMP2和整合素β1改變。④應(yīng)用Transwell小室建立腫瘤體外侵襲模型，觀察pshPPARγ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)HCCLM3細(xì)胞黏附、遷移、侵襲能力的影響，應(yīng)用過河實(shí)驗(yàn)

5、觀察細(xì)胞移動(dòng)能力的改變，應(yīng)用HCCLM3細(xì)胞與ECV304細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察pshPPARγ對(duì)其形成管腔能力的影響。應(yīng)用裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的肺組織連續(xù)切片，HE染色和hepatocyte免疫組織化學(xué)鑒定肺轉(zhuǎn)移灶并計(jì)數(shù)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植瘤VEGF、TSP1和肺轉(zhuǎn)移灶中整合素β1蛋白表達(dá)，RT—PCR檢測(cè)移植瘤VEGF、TSP1以及肺轉(zhuǎn)移灶整合素β1 mRNA表達(dá)。 結(jié)果：⑴PPARγ mRNA在細(xì)胞株L—02、HepG2

6、、HepG2.2.15及HCCLM3中均有表達(dá)，與GAPDH的相對(duì)灰度值比分別為0.905±0.028，1.547±0.071，1.887±0.085和1.497±0.061，L—02與肝癌細(xì)胞株之間存在顯著性差異（F=118.84，P<0.01）；HepG2.2.15與HepG2、HCCLM3之間亦有差異（F=25.33，P<0.01）；Western blot法檢測(cè)結(jié)果與RT—PCR結(jié)果一致。⑵pshPPARγ經(jīng)測(cè)序鑒定與設(shè)計(jì)目的序

7、列完全一致。pshPPARγ轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞后40h、應(yīng)用600μg/ml的G418篩選的陽性克隆細(xì)胞中PPARγ mRNA表達(dá)降低，與對(duì)照組比較存在顯著性差異（F=29.47和75.22，P<0.01），對(duì)照組之間無差異（t=0.526和0.703，P>0.05），蛋白水平的靜默效率與mRNA水平一致，抑制效率均在80%以上。⑶pshPPARγ轉(zhuǎn)染HCCLM3后40h，MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞增殖抑制率達(dá)71.5%。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示ps

8、hPPARγ組凋亡率為23.2±4.2%，裸質(zhì)粒組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為3.3±0.9%和3.1±0.7%，pshPPARγ組凋亡明顯增多，存在顯著差異（F=48.32，P<0.01）。TUNEL法原位凋亡指數(shù)結(jié)果與流式細(xì)胞儀結(jié)果類似。pshPPARγ組移植瘤內(nèi)PPARγ蛋白和mRNA均下調(diào)，成瘤潛伏期延長，移植瘤生長減慢，瘤體積為1.86±0.65 cm3，而對(duì)照組為4.86±1.15 cm3，成瘤潛伏期、生長曲線及瘤體積與對(duì)照組比

9、較，P均<0.05；pshPPARγ組原位凋亡明顯增多。在細(xì)胞和動(dòng)物模型中，pshPPARγ組PCNA表達(dá)減少，而野生型P53增多，與對(duì)照組比較，P<0.05；RT—PCR顯示pshPPARγ組MMP2、整合素β1表達(dá)下調(diào)，TIMP2表達(dá)上調(diào)。⑷psbPPARγ組跨過半透膜的細(xì)胞數(shù)為68±7，明顯少于裸質(zhì)粒組和對(duì)照組的280±10和302±14（F=548.72，P<0.01）；透過ECM的細(xì)胞數(shù)量為17±3，亦明顯少于對(duì)照組（F=25

10、8.19，P<0.01）；細(xì)胞越過劃痕的時(shí)間為6.40±1.14d，與對(duì)照組存在顯著性差異（F=17.58，P<0.01）；細(xì)胞黏附能力亦顯著下降，2h后pshPPARγ組粘附的細(xì)胞數(shù)為49±9，而對(duì)照組為83±13和88±11（F=17.39，P<0.01）。pshPPARγ明顯降低ECV304細(xì)胞體外形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力。pshPPARγ組裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶小，整肺總轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于對(duì)照組（t=18.69，P<0.05）。pshPPAR

11、γ組移植瘤的微血管（MV）少且多呈點(diǎn)狀，而對(duì)照組密集且出現(xiàn)環(huán)形，兩組MVD計(jì)數(shù)有顯著性差異，P<0.05；移植瘤塊中存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象（VM），pshPPARγ組稀疏分布，細(xì)??；VEGF在pshPPARγ組表達(dá)下調(diào)，而TSP1上調(diào)。整合素β1表達(dá)在肺轉(zhuǎn)移灶無變化。 結(jié)論：①過氧化物酶體增殖物活化受體γ在肝癌中過表達(dá)，與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是判斷肝癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。②成功構(gòu)建無內(nèi)毒素的靶向PPARγ基因的shRNA重組質(zhì)粒表

12、達(dá)載體，能穩(wěn)定抑制HCCLM3細(xì)胞中PPARγ活性，為利用RNAi技術(shù)在細(xì)胞和在體水平研究PPARγ在肝癌中的作用機(jī)制、探索HCC的基因治療打下了基礎(chǔ)。③PPARγ基因靜默能抑制HCCLM3細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡；此作用可能經(jīng)由整合素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)MMP2/TIMP2平衡，降低PCNA表達(dá)和促進(jìn)wt—P53起作用。④PPARγ基因靜默能抑制HCCLM3細(xì)胞侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，減少肝癌血管生成；此作用亦可能經(jīng)由整合素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)MMP2/TIM