巨噬細胞過氧化物酶體與鼠傷寒沙門菌相互作用的初步分析.pdf

1、鼠傷寒沙門菌屬于腸桿菌科，是重要的腸道致病菌，致病譜從自限性的胃腸炎到危及生命的全身性系統(tǒng)疾病。沙門菌是兼性細胞內寄生菌，在感染致病過程中侵入許多吞噬和非吞噬細胞并在宿主細胞內寄生存活。巨噬細胞是鼠傷寒沙門菌感染的重要宿主，在疾病的發(fā)展及轉歸中起重要作用。感染鼠傷寒沙門菌的宿主細胞啟動誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）系統(tǒng)產生一氧化氮（nitric oxide, NO）及活性氮

2、化合物（reactive nitrogen species，RNS）抑制和殺滅細胞內沙門菌。iNOS在不同細胞可定位于胞漿、囊泡和過氧化物酶體。本研究中，使用活的和滅活的鼠傷寒沙門菌（ATCC 14028）感染鼠巨噬細胞（RAW264.7）和昆明小鼠。研究感染過程中巨噬細胞iNOS、過氧化物酶體膜表面蛋白70（The 70-kDa PeroxisomAlMembrane Protein，PMP70）的表達和細胞內鼠傷寒沙門菌數(shù)量的關系；

3、使用iNOS選擇性抑制劑1400W（N-(3-[Aminomethyl]benzyl)acetamidine）預處理巨噬細胞，檢測活菌感染細胞的培養(yǎng)液NO濃度、計數(shù)細胞內細菌數(shù)量；檢測感染昆明小鼠血漿和肝臟NO濃度。對比以上檢測活菌和滅活菌間的差異，及隨感染時間變化的差異，探討鼠傷寒沙門菌感染的特點；對比使用和未使用1400W處理感染細胞的結果，探討iNOS在沙門菌感染中的作用。研究感染巨噬細胞內iNOS、過氧化物酶體和沙門菌三者之間的

4、定位關系，探討過氧化物酶體的抗菌功能，為沙門菌感染的治療提供依據(jù)。
　　 一、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞誘導iNOS表達的檢測
　　 用活的和滅活的鼠傷寒沙門菌以細菌：細胞比為20：1，即感染復數(shù) （Multiplicity of Infection，MOI）為20，感染RAW264.7 1h，用PBS洗掉細胞外游離細菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時間（1h、4h、8h、12h、24h）做以下檢測。提取活菌和滅活菌兩感染組各感染時間的

5、細胞總RNA，用隨機引物逆轉錄cDNA做實時定量PCR（Real-time PCR）以GAPDH為參比基因檢測目的基因iNOS。用Griess試劑測定兩感染組各感染時間的細胞培養(yǎng)液NO濃度。結果顯示兩感染組均在感染的前12h iNOS mRNA表達呈持續(xù)升高。在12h達最高值，活菌感染和滅活菌感染分別為未感染對照的21.723倍和22.051倍，兩數(shù)據(jù)間比較無明顯差異。而在1h、4h、8h、24h時滅活菌感染細胞iNOS mRNA的表達

6、均顯著高于活菌感染細胞的表達。兩感染組細胞培養(yǎng)液NO濃度同樣在感染的前12h表達呈持續(xù)升高，在12h達最高值后下降。在相同的各指定時間點活菌感染的細胞上清NO濃度均顯著低于滅活菌感染組?？傊罹腥竞蜏缁罹腥揪茱@著誘導RAW264.7 iNOS mRNA的表達和NO濃度的升高，但滅活菌比活菌誘導能力更強。這些結果說明鼠傷寒沙門菌感染能顯著誘導巨噬細胞iNOS的表達。
　　 結合感染細胞內細菌計數(shù)結果表明，活菌對iNOSmRN

7、A的表達和NO的生成有抑制作用。
　　 二、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞內細菌計數(shù)
　　 用活菌和滅活的鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染RAW264.7 1h，用PBS洗掉細胞外游離細菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時間（1h、4h、8h、12h、24h）。取活菌和滅活菌感染各時間的細胞爬片，用4％多聚甲醛固定，做免疫熒光標記細胞內沙門菌，在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)細胞內細菌。收集活菌感染各時間點的細胞，用0.1％Triton X-100PBS

8、裂解細胞。取裂解液用LB平板做細菌培養(yǎng)，計數(shù)平板的菌落數(shù)，計算細胞內的活菌數(shù)。對細菌計數(shù)結果進行統(tǒng)計學分析，結果顯示活菌感染的免疫熒光染色細菌計數(shù)和裂解細胞細菌計數(shù)間差異顯著，結合兩種計數(shù)方法的特點，差異為細胞內部分活菌被細胞殺滅?；罹腥镜拿庖邿晒庥嫈?shù)和裂解細胞活菌計數(shù)顯示，在前12h內細菌數(shù)量逐漸增多，在12h達最大值。1h、4h、8h兩計數(shù)方法結果間差異無統(tǒng)計學意義；在12h和24h兩計數(shù)結果間差異顯著，有統(tǒng)計學意義。在24h免疫

9、熒光細菌計數(shù)為13.857個/細菌為裂解細胞活菌計數(shù)7.940個/細菌的1.744倍，有顯著差異，即此時細胞內細菌部分被殺滅。滅活菌感染細胞內細菌計數(shù)在不同時間點計數(shù)間差異顯著，即細菌因被細胞降解而減少。結合感染細胞的熒光顯微鏡圖片，滅活菌被細胞降解逐漸變小成細顆粒。以上結果結合iNOS表達的結果說明活的鼠傷寒沙門菌在巨噬細胞內增殖，誘導細胞iNOS表達，生成殺菌物質NO，濃度達到一定水平細菌被殺滅，滅活的細菌被細胞降解。
　　

10、 三、1400W預處理巨噬細胞感染各時間點細胞培養(yǎng)液NO濃度和細胞內沙門菌計數(shù)
　　 將巨噬細胞接種在6孔板，使用1400W終濃度為50umol/L的10％DMEM預處理24h。然后以MOI=20用鼠傷寒沙門菌活菌感染巨噬細胞1h，用PBS洗掉細胞外游離細菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時間（1h、4h、8h、12h、24h），在培養(yǎng)細胞整個過程中均使用1400W終濃度為50umol/L的10％DMEM。使用Griess試劑檢測感染各時間點培

11、養(yǎng)液的NO濃度。通過免疫熒光染色沙門菌和使用0.1％Triton X-100PBS裂解細胞做細菌培養(yǎng)計數(shù)細胞內細菌。結果顯示1400W處理細胞未感染及感染各時間點細胞培養(yǎng)液NO濃度差異無統(tǒng)計學意義，其NO濃度顯著低于未使用1400W處理的感染細胞培養(yǎng)液NO濃度，即感染細菌誘導的iNOS活性被1400W完全抑制。1400W處理后各感染時間的感染細胞內細菌的兩種方法計數(shù)結果均比未使用1400W處理感染細胞內細菌的相同方法細菌計數(shù)明顯增多。1

12、400W處理的感染細胞免疫熒光染色細胞內細菌計數(shù)和裂解細胞存活菌計數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義。以上結果說明，使用1400W抑制iNOS活性，殺菌物質NO生成顯著減少，在低濃度NO時細胞內細菌增殖和存活均顯著高于未使用1400W處理的感染細胞。
　　 四、昆明小鼠感染鼠傷寒沙門菌期間血漿和肝臟NO濃度的檢測
　　 用活菌和滅活的鼠傷寒沙門菌以1.75×107個/只，腹腔接種感染昆明小鼠。分別在感染后1h、4h、8h、12h、24

13、h取血分離血漿，斷頸處死小鼠解剖取肝臟，檢測血漿和肝組織的NO濃度。結果顯示活菌比滅活菌感染能顯著引起小鼠血漿和肝組織NO濃度升高。活菌感染的昆明小鼠血漿NO濃度在1h時即明顯升高，隨后逐漸升高在12h達最高值，為未感染組的5.823倍；肝組織NO濃度在感染后升高，在8h～12h持續(xù)處于高水平。滅活菌感染的昆明小鼠血漿和肝組織NO濃度升高變化平緩。相同時間點活菌和滅活菌感染小鼠的血漿NO濃度均有顯著差異；相同時間點活菌和滅活菌感染小鼠的

14、肝組織NO濃度在1h時無顯著差異，其他時間點有顯著差異。這些結果說明活菌比滅活菌感染更易引起小鼠血漿和肝臟生成NO，沙門菌感染至肝臟時誘導肝細胞NO生成。
　　 五、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞誘導PMP70mRNA表達的檢測
　　 提取活菌和滅活菌以MOI=20感染RAW264.7細胞1h并培養(yǎng)到指定各時間點（1h、4h、8h、12h、24h），提取細胞總RNA，用隨機引物逆轉錄cDNA，做實時定量PCR，以GAPDH為參

15、比基因檢測目的基因PMP70。結果顯示，活菌感染各時間點PMP70mRNA的表達差異顯著，有統(tǒng)計學意義；滅活菌感染各時間點PMP70mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義?；罹蜏缁罹鷮MP70mRNA表達的誘導存在顯著差異?；罹腥窘MPMP70mRNA表達隨時間升高后降低在8h達最高值為對照的2.307倍，8h、12h和24h均顯著高于對照組和相同時間點的滅活菌感染組。結果說明活菌比滅活菌感染更能有效誘導PMP70mRNA的表達。
　

16、　 六、感染巨噬細胞內iNOS、過氧化物酶體和鼠傷寒沙門菌的定位關系的研究
　　 用鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染鼠巨噬細胞1h并培養(yǎng)到12h。做免疫熒光兩兩標記iNOS、過氧化物酶體、鼠傷寒沙門菌，通過共聚焦熒光顯微鏡觀察三者在細胞內的定位關系。用鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染鼠巨噬細胞1h并培養(yǎng)到12h，用免疫膠體金標記過氧化物酶體，通過透射電鏡觀察過氧化物酶體與鼠傷寒沙門菌的定位關系。免疫熒光結果顯示在感染的巨噬細胞內i

17、NOS、過氧化物酶體、鼠傷寒沙門菌存在兩兩的共定位關系。電鏡結果顯示標記金顆粒的過氧化物酶體和含沙門菌囊泡緊靠在一起。結果說明感染巨噬細胞內iNOS定位于過氧化物酶體參與細胞內沙門菌的殺滅。
　　 本課題實驗結果表明，鼠傷寒沙門菌的感染能有效誘導宿主細胞iNOS mRNA的表達和殺菌物質NO的生成，殺菌物質達到一定水平時，感染細胞內部分沙門菌被殺滅?；罹腥緦奘杉毎鹖NOS的表達有抑制作用。1400W選擇性抑制iNOS活性后，