基于ccr5、pol和vif基因的三聯(lián)miRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及功能分析.pdf

1、背景及目的：RNAi技術(shù)在抗HIV-1研究方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力。針對(duì)HIV-1病毒的高突變性，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，以ccr5、pol和vif基因?yàn)榘悬c(diǎn)構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株293T-CCR5、293T-POL和293T-VIF；針對(duì)3個(gè)靶基因各自設(shè)計(jì)和構(gòu)建了4個(gè)miRNA表達(dá)載體，從中各篩選出一個(gè)沉默效果最好的，記為pccr5-1-4， ppol-3-4和pvif-2-1。在此基礎(chǔ)上，本研究將3個(gè)miRNA串聯(lián)到一個(gè)表達(dá)載體上，并

2、利用 Gatewan重組技術(shù)構(gòu)建成慢病毒表達(dá)載體 pLenti6.3-ccr5-pol-vif，理論上，該重組載體可同時(shí)作用于三個(gè)靶基因。將其轉(zhuǎn)染進(jìn)293T-CCR5細(xì)胞，293T-POL細(xì)胞和293T-VIF細(xì)胞，進(jìn)行功能分析，為進(jìn)一步開展抗HIV-1研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：pcDNA?6.2-GW/EmGFP載體上含有酶切位點(diǎn)BamH I，Xho I和Bgl II，且BamH I與Bgl II是同尾酶，利用這一特性將載體中目

3、的片段miR-ccr5，miR-pol和miR-vif串聯(lián)起來，獲得 pcDNA?6.2-GW/EmGFP-ccr5-pol-vif；Eag I單酶切載體pcDNA?6.2-GW/EmGFP-ccr5-pol-vif后，利用Gatewan重組技術(shù)構(gòu)建成慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-ccr5-pol-vif，重組載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其正確性；通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其對(duì)靶基因的抑制效率和對(duì)IFN-β表達(dá)的影響；Western Blot法檢

4、測(cè)其對(duì)CCR5、POL和VIF蛋白表達(dá)的影響；采用MTT法檢測(cè)其對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞有無毒性傷害。結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明重組載體構(gòu)建成功；qRT-PCR結(jié)果顯示 pLenti6.3-ccr5-pol-vif對(duì)ccr5、pol和vif基因都有一定抑制作用，抑制效率分別達(dá)到25％、35%和13%；Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了pLenti6.3-ccr5-pol-vif的293T-CCR5、293T-POL和293T-VIF細(xì)胞中，靶蛋白表達(dá)水

5、平與空白對(duì)照組相比分別降低18%、55%和65%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)未明顯增加；MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染pLenti6.3-ccr5-pol-vif不會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活率造成影響。
　　結(jié)論：1.成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-ccr5-pol-vif；2. pLenti6.3-ccr5-pol-vif可同時(shí)靶向ccr5、pol和vif三個(gè)基因發(fā)揮抑制作用；3. pLenti6.3-ccr5-pol-vi