2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩57頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、背景及目的:
  肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種與多種病因有關(guān)的進(jìn)展性疾病,其病理基礎(chǔ)是肺動脈壁的內(nèi)皮或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,致使肺血管內(nèi)皮功能紊亂及肺血管重構(gòu)。因此,有效解決內(nèi)皮功能紊亂及盡早阻止并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、擴(kuò)大血管床橫截面積才可能從根本上解決PAH。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)是調(diào)控血管張力和通透性的

2、重要分子,主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中,是血管壁上一氧化氮(NO)的主要來源,血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO可通過多途徑發(fā)揮抗PAH的作用。而位于胞膜窖(Caveolae)的窖蛋白-1(Caveolin-1)是調(diào)節(jié)eNOS的關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)控因子。主要是位于Caveolin-1的92位苯丙氨酸與eNOS結(jié)合而發(fā)揮抑制效應(yīng),而用丙氨酸(F92A)代替92位苯丙氨酸后獲得的突變型F92A-Caveolin-1(F92A-Cav-1、Caveolin-1 mut

3、)不具有抑制eNOS的作用。因此,通過改變基因Caveolin-1對eNOS的負(fù)調(diào)控作用,可增加eNOS的活性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對NO的分泌,從而有利于PAH的治療。
  本研究旨在構(gòu)建攜帶eNOS和F92A-Caveolin-1目的基因的慢病毒載體,并對其功能進(jìn)行檢測分析,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定科研基礎(chǔ)。
  方法:
  1)根據(jù)質(zhì)粒(eNOS、F92A-Cav-1)分別設(shè)計引物,并分別在5'端和3'端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)

4、,與慢病毒載體骨架(pLVX-mCMV-mCherry)的酶切位點(diǎn)相同。采用Polymerase chain reaction(PCR)擴(kuò)增eNOS及F92A-Cav-1目的片段;通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑取克隆并篩選陽性克隆,通過PCR鑒定、測序及酶切鑒定等步驟,鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為: pLVX-eNO S-P2A-F92-Caveolin-1-mCMV-mCherry(LV-eNOS/F92-Cav-1)。2)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

5、(Lipofectamine2000),使用人胚腎細(xì)胞(293-T細(xì)胞)進(jìn)行包裝,可獲得慢病毒Lenti-eNOS/F92-Cav-1,收集感染后48小時及72小時的病毒上清液,采用PEG-it濃縮病毒,采用稀釋法測定病毒滴度,并測定293-T細(xì)胞的感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI)。3)以MOI=1的慢病毒顆粒Lenti-eNOS/F92-Cav-1感染293-T細(xì)胞,熒光顯微鏡下檢測感染陽性率。4

6、)鑒定質(zhì)粒功能,將293-T細(xì)胞分三組:①實(shí)驗(yàn)組:慢病毒顆粒(Lenti-eNOS/F92-Cav-1)感染組;②陰性對照組:空載體(pLVX-mCMV-mCherry)感染組;③空白對照組(Control組)。實(shí)驗(yàn)組按MOI=1感染293-T細(xì)胞,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法檢測eNOS蛋白(表達(dá)綠色熒光)表達(dá)水平,再以DAF-FM DA方法(NO熒光探針法)檢測NO生成量。
  結(jié)果:
  1.通過陽性克隆PCR鑒定,測序及

7、酶切鑒定,提示慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV-eNOS/F92-Cav-1構(gòu)建成功。
  2.病毒滴度為2×108TU/ml,慢病毒感染293-T感染指數(shù)(MOI)值為1。
  3.按MOI=1感染293-T細(xì)胞陽性率可達(dá)80%以上。
  4.與陰性對照組及Control組相比,實(shí)驗(yàn)組eNOS蛋白表達(dá)水平及NO生成量均升高。
  結(jié)論:
  1.成功構(gòu)建了攜帶目的基因eNOS/F92A-Caveolin-1的慢病毒載體

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論