水稻雌性不育基因PTB1載體構(gòu)建及初步功能分析.pdf

1、人類的糧食主要來自于植物的果實，植物的育性水平直接關(guān)系到產(chǎn)量的高低。植物雌性不育雖然對植物本身不利，但是對于植物育性機理研究卻是一個良好的切入點。自上個世紀50年代就開始有植物雌性不育現(xiàn)象的報道以來，植物的雌性不育現(xiàn)象就長期受到廣泛的的關(guān)注，但是對其不育的機理還知之甚少。近年來，科學家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定出了很多生殖相關(guān)突變體或基因，部分生殖發(fā)育的相關(guān)機制也在逐漸明朗。但是，還有很多有關(guān)生殖發(fā)育分子機理還知之甚少，而這些機理的深入探討有待于

2、更多突變體的發(fā)掘和研究。本實驗研究的突變體材料來自一份穩(wěn)定的秈稻恢復系蜀恢202的自然突變材料，它不同于所報道過的秈粳交后代及離體培養(yǎng)產(chǎn)生的雌性不育突變體，而且其外部的表型特征就與目前報道過的突變體有較大差異，有可能是一個全新類型的雌性不育突變材料。因此，對它的深入研究將是對雌性不育研究的一個重大補充。
　　 本研究以一份源自秈型恢復系蜀恢202的自然不育突變株作為材料。在本實驗室的前期研究中，已將該基因精細定位在水稻第五染色體

3、上60k范圍內(nèi)，并經(jīng)序列比對分析篩選出候選基因，并構(gòu)建好部分用于基因功能驗證的中間載體PBS-PT,PBS-Ppt,PBS-PI1,PBS-PI2。本研究以這些中間載體為基礎(chǔ)構(gòu)建PTBI基因過量表達，互補，RNA干擾，組織表達等真核表達載體，和蛋白細胞定位瞬時表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導法和瞬時轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化水稻、擬南芥和洋蔥等，以研究該基因的功能和表達模式特征。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以構(gòu)建好的中間載體PBS-PT,PBS

4、-Ppt,PBS-PI1,PBS-PI2為供體，以植物表達載體PHB為受體構(gòu)建PTB1基因過量表達載體PHB-PT-OVE、互補表達載體PHB-Ppt-PT、RNA干擾表達載體PHB-PI1和PHB-PI2;以真核表達載體P1300-GUS為受體構(gòu)建PTB1基因組織表達載體P1300-Ppt-GUS;以瞬時表達載體PA7-YFP為受體構(gòu)建PTB1蛋白細胞定位瞬時表達載體PA7-35s-PT-YFP。并通過酶切和測序的方法鑒定上述表達載體

5、的正確性。
　　 2.將PTB1基因互補表達載體PHB-Ppt-PT利用農(nóng)桿菌介導的方法導入fs-202R突變體幼穗誘導的胚性愈傷組織中，經(jīng)組織培養(yǎng)，抗性篩選分化，獲得再生抗性植株。經(jīng)PCR和Basta除草劑檢測，成功獲得了14株轉(zhuǎn)基因陽性植株。
　　 3.將獲得的T0代陽性植株種子分單株種植5個株系，在成熟期進行田間調(diào)查，觀察到每個株系內(nèi)T1代均發(fā)生可育和不可育的性狀分離。T1代植株經(jīng)PCR和Basta檢測發(fā)現(xiàn)目的基因

6、與與植株育性恢復性狀緊密連鎖，表明通過目的基因的導入恢復了突變體的育性。
　　 4.將PTB1基因組織表達載體P1300-Ppt-GUS通過農(nóng)桿菌介導的方法導入擬南芥并獲得抗性植株。將整株陽性小苗和成熟苗的組織器官進行GUS染色，結(jié)果表明GUS基因在擬南芥幼苗和營養(yǎng)器官中的維管束組織表達，在生殖器官中則在雌蕊和雄蕊中表達。
　　 5.利用基因槍法將PTB1基因蛋白細胞定位瞬時表達載體PA7-35s-PT-YFP導入洋蔥表

7、皮細胞，得到洋蔥瞬時表達細胞。通過激光共聚焦顯微鏡對洋蔥瞬時表達細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)YFP基因在洋蔥的細胞膜，細胞質(zhì)，細胞核中均有表達。
　　 6.通過農(nóng)桿菌介導的方法將PTBI基因過量表達載體PHB-PT-OVE導入fs-202R突變體幼穗誘導和Kasa1ath成熟胚誘導的胚性愈傷組織中，經(jīng)組織培養(yǎng)，抗性篩選分化，獲得再生抗性小苗。抗性植株經(jīng)PCR檢測，成功獲得3株fs-202R轉(zhuǎn)基因陽性幼苗和10株Kasalath轉(zhuǎn)基因陽性苗