水稻光敏感雄性核不育基因pms1的克隆與功能分析.pdf

1、水稻是全球一半以上人口的主糧，如何提高水稻產(chǎn)量一直是各國科學(xué)家致力于解決的關(guān)乎國計(jì)民生的重大課題。50年前袁隆平先生提出了雜交稻的構(gòu)想，并隨后將之應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，為我國糧食安全做出了巨大的貢獻(xiàn)。中國雜交稻的生產(chǎn)經(jīng)歷了從三系稻到兩系稻的發(fā)展，兩系稻占我國雜交稻種植面積的比例越來越高。相對(duì)于三系不育系，兩系不育系恢復(fù)系廣、配組更為自由，大大簡化了雜交過程，應(yīng)用潛力巨大。兩系不育系是指光溫敏雄性不育系，其育性受到溫度和光照長度的影響:光敏不

2、育系在長日照下不育、短日照下可育;溫敏不育系在高溫下不育、低溫下可育。粳稻品種農(nóng)墾58S是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)也是研究和應(yīng)用最廣泛的光敏雄性不育系，以農(nóng)墾58S為基因源培育出了大批優(yōu)良的光溫敏雄性不育系。為了更好地利用兩系不育系，有必要分離控制光溫敏雄性不育性的基因并闡明其分子作用機(jī)理。pms1是農(nóng)墾58S中控制光敏雄性核不育的主效基因，我們構(gòu)建了農(nóng)墾58S與明恢63的高世代回交群體以圖位克隆pms1基因并對(duì)其進(jìn)行功能分析，得到的主要研究結(jié)果如

3、下:
　　1.與以往的認(rèn)識(shí)不同，通過對(duì)農(nóng)墾58S與明恢63回交F2群體的結(jié)實(shí)率和基因型分析表明，光敏感雄性核不育基因pms1是一個(gè)不完全顯性基因。在長日照下BC5F2群體中純合的農(nóng)墾58S pms1位點(diǎn)表現(xiàn)為完全不育;純合的明恢63 pms1位點(diǎn)表現(xiàn)為完全可育;而雜合基因型的育性呈現(xiàn)出從不育到可育連續(xù)分布的趨勢(shì)，并且絕大部分植株育性低于60％。明恢63純合、雜合及農(nóng)墾58S純合這三種基因型單株數(shù)的比例符合1∶2∶1的單基因分離比。

4、
　　2.在確定了pms1顯隱性的基礎(chǔ)上對(duì)6841個(gè)BC5F2群體單株用兩端分子標(biāo)記pj23和Fssr進(jìn)行基因型分析，共得到88個(gè)重組單株。再利用新開發(fā)的11個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)一步縮小定位區(qū)間。由于雜合基因型單株與農(nóng)墾58S純合基因型單株間育性的重疊，為了定位的可靠性，僅利用雜合基因型和明恢63純合基因型發(fā)生交換的重組單株進(jìn)行精細(xì)定位。最終將pms1定位于分子標(biāo)記P4和P6之間4.0 kb的范圍內(nèi)，左右各1個(gè)重組單株，分子標(biāo)記P5與pm

5、s1共分離。
　　3.將農(nóng)墾58S中包含有該4.0 kb的基因序列互補(bǔ)轉(zhuǎn)化到近等基因系NIL(MH)中，能降低受體長日照下的育性，短日照下無影響;反之，將對(duì)應(yīng)來自于明恢63中的序列轉(zhuǎn)化到農(nóng)墾58S中沒有表型的改變，說明該區(qū)域內(nèi)確實(shí)包含有pms1的候選基因。
　　4.采用RACE的方法在定位區(qū)間內(nèi)分離到一條全長cDNA，將此轉(zhuǎn)錄本命名為PMS1T。在長日照下抑制農(nóng)墾58S中PMS1T的表達(dá)能夠恢復(fù)育性，NIL(MH)中抑制PM

6、S1T的表達(dá)對(duì)育性無影響;在NIL(MH)中超量表達(dá)PMS1T也能導(dǎo)致育性下降。這些結(jié)果都表明PMS1T就是控制光敏雄性不育的基因pms1。
　　5.對(duì)PMS1T表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)PMS1T在與花粉發(fā)育相關(guān)的組織中表達(dá)量較高，在營養(yǎng)生長器官中表達(dá)量很低，并且在二次枝梗原基分化期、雌雄蕊形成期和花粉母細(xì)胞形成期的幼穗中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，這三個(gè)時(shí)期也正是光敏感雄性不育的敏感時(shí)期。qPCR結(jié)果表明在這三個(gè)時(shí)期中長日照下農(nóng)墾58S中PMS1T的表達(dá)量

7、低于NIL(MH)及短日照下的農(nóng)墾58S和NIL(MH)。
　　6.PMS1T在農(nóng)墾58S和明恢63中的長度分別為1，453 bp和1，388bp，兩者相差65bp。在PMS1T的5'端還存在兩個(gè)SNP位點(diǎn)S1和S2，SNP S2和分子標(biāo)記P5與pms1共分離。在多個(gè)水稻品種中對(duì)這幾個(gè)序列差異進(jìn)行比較測(cè)序表明SNP S2是造成光敏雄性不育的功能性突變。
　　7.PMS1T沒有intron，位于基因間區(qū)，沒有基因注釋。預(yù)測(cè)有三

8、個(gè)短的ORF，將農(nóng)墾58S這三個(gè)預(yù)測(cè)ORF的起始密碼子ATG后面插入堿基“G”，分別互補(bǔ)轉(zhuǎn)化NIL(MH)，仍然能夠正常發(fā)揮功能，降低NIL(MH)的育性，說明PMS1T不編碼蛋白，是一個(gè)長鏈非編碼RNA。
　　8.5' RLM-RACE和降解組測(cè)序數(shù)據(jù)證實(shí)了PMS1T能夠被miR2118剪切。對(duì)長、短日照下農(nóng)墾58S和NIL(MH)雌雄蕊形成期、花粉母細(xì)胞形成期和減數(shù)分裂期幼穗進(jìn)行Small RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)PMS1T能夠

9、從miR2118剪切位點(diǎn)開始形成18對(duì)21ntphasiRNA。這些PMS1T-phasiRNA的表達(dá)量在花粉母細(xì)胞形成期和減數(shù)分裂期幼穗中高于雌雄蕊形成期，其中4s phasiRNA和6s phasiRNA的量遠(yuǎn)高于其他phasiRNA。比較分析花粉母細(xì)胞形成期幼穗中的PMS1T-phasiRNA，在長日照下的農(nóng)墾58S中表達(dá)量高于其他三種材料。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PMS1T-phasiRNA的表達(dá)量與PMS1T轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。此外還分析

10、了長日照花粉母細(xì)胞形成期幼穗中PMS1T-phasiRNA在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量。在超量表達(dá)農(nóng)墾58SPMS1T轉(zhuǎn)基因植株中，phasiRNA的表達(dá)量在陽性植株中高于陰性植株;與此相吻合的是，農(nóng)墾58S PMS1T抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽性單株中phasiRNA的表達(dá)量低于陰性單株。這些結(jié)果表明PMS1T-phasiRNA與光敏雄性不育相關(guān)。轉(zhuǎn)基因結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)失去了完整miR2118識(shí)別位點(diǎn)的農(nóng)墾58S PMS1T不能發(fā)揮正常功能來降低NI