RNA干擾技術(shù)沉默血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)基因?qū)κ彻馨┑姆乐巫饔?pdf

1、研究背景及目的：食管癌是我國的高發(fā)癌種，死亡率高，居于我國惡性腫瘤死亡率的第4位，其分布有明顯的地域性，山東省是我國食管癌高發(fā)區(qū)之一。食管癌與其他消化道腫瘤一樣呈高侵襲性生長，并且容易發(fā)生擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。
　　 血管生成(angiogenesis)存在于許多生理和病理過程中，它既可參與胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、女性生殖周期等生理過程，又是炎癥反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、視網(wǎng)膜病、腫瘤等病理過程中的重要環(huán)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)血管生成對實(shí)體腫瘤

2、的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的作用尤為重要。實(shí)驗(yàn)研究表明，抗血管新生治療可以抑制腫瘤的生長，降低其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的能力[1]。血管生成是一個(gè)多因素參加的協(xié)同作用過程，受多種因子的調(diào)控。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)是最主要的促血管生成因子，在血管生成過程中發(fā)揮著重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子在肝癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等中的作用已經(jīng)得到證實(shí)[4-15]，而其對食管癌生物學(xué)行為的影響

3、方面文獻(xiàn)報(bào)告不多。
　　 RNAi是指雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后特異性阻斷與其同源的基因表達(dá)的現(xiàn)象。它是當(dāng)前研究基因功能的重要工具，而且已有人將其用于腫瘤、病毒感染基因治療的研究。用慢病毒(Lentivirus)做載體介導(dǎo)RNAi用于基因治療的研究更有實(shí)際應(yīng)用潛力，因?yàn)榕c其它病毒載體系統(tǒng)相比，慢病毒能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂(Non-dividing)細(xì)胞并將shRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)整合到宿主細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定沉默。
　　

4、 本文從蛋白水平研究VEGF-C基因在食管癌中的表達(dá)，觀察其與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系；我們用RNA干擾技術(shù)破壞VEGF-C mRNA，使VEGF-C蛋白的合成處在極低的水平，降低VEGF-C積聚及對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，能夠在很大程度上阻斷腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答，建立一種基因修飾食管癌治療策略，提高食管癌的治療效果，為探討以VEGF-C為靶標(biāo)建立食管癌早期診斷和基因治療方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對策。
　　 第一部分 VEGF-C基因在食管癌

5、組織中表達(dá)水平的研究
　　 [方法]：
　　 選取山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科1998～2001年手術(shù)切除的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本46例。男性36例，女性10例；年齡30歲～74歲，中位年齡56歲；根據(jù)組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)28例，Ⅲ級(jí)10例；根據(jù)浸潤深度分為三組：侵及黏膜固有層或黏膜下層2例，侵及肌層21例，侵及纖維外膜22例，侵及胸主動(dòng)脈1例；區(qū)域淋巴結(jié)：有轉(zhuǎn)移14例，無轉(zhuǎn)移32例；根據(jù)UICC1997年分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期

6、2例，Ⅱa期31例，Ⅱb期5例，Ⅲ期8例。所有病例均隨訪5年以上。術(shù)前均未行放、化療。
　　 免疫組化按武漢博士德生物公司SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作，兔抗人VEGF-C多克隆抗體(工作濃度1:50)、兔抗人F8因子相關(guān)抗原抗體(工作濃度1:200)。VEGF-C陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野下觀察，>30％腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于正常平滑肌細(xì)胞染色者判為“+”；<30％腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度高于正常平滑肌細(xì)胞或腫瘤

7、細(xì)胞染色與正常平滑肌細(xì)胞相近者判為“±”；腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度低于正常平滑肌細(xì)胞染色者判為“-”?！?”者判定為VEGF-C陽性表達(dá)。MVD計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：先于100倍視野下掃視整個(gè)切片找到高血管密度區(qū)，即“熱點(diǎn)”(Hot Spot)，再以200倍視野下(0.7386mm2/視野)計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，分別計(jì)數(shù)3個(gè)不同視野，取其最高值表示MVD。計(jì)數(shù)微血管時(shí)，無論是否有血管腔，凡是呈棕褐色染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞簇，與鄰近的組織有明確界限者均計(jì)數(shù)在內(nèi)。

8、血管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑總和及正常粘膜下區(qū)的微血管不計(jì)數(shù)在內(nèi)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：VEGF-C的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、病理分期(pTNM)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后生存期關(guān)系以x2或四格表確切概率法檢驗(yàn)；VEGF-C的表達(dá)與MVD關(guān)系以秩和檢驗(yàn)；VEGF-C的表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件繪制Kaplan-Meier曲線(生存率曲線)表示，生存率差異性檢驗(yàn)采用時(shí)序檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

9、r>　　 [結(jié)果]：
　　 VEGF-C陽性物質(zhì)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，腫瘤浸潤邊緣陽性染色強(qiáng)度高于腫瘤中心區(qū)域。在食管鱗癌組織中VEGF-C的陽性表達(dá)率為45.65％(21/46)，顯著高于食管正常黏膜組織(P<0.05)；VEGF-C的陽性表達(dá)與食管鱗癌的浸潤深度(T1-2，30.43％；T3-4，60.87％；P<0.05)、分化程度(Ⅰ，00％；Ⅱ，50.00％；P<0.05；Ⅰ，0.0％；Ⅲ，70.00％；P<0.

10、01)及MVD(P<0.05)顯著相關(guān)。VEGF-C陽性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。生存分析顯示46例患者總的5年生存率為36.96％，其中VEGF-C陽性表達(dá)者術(shù)后5年生存率為14.29％，VEGF-C陰性表達(dá)者術(shù)后5年生存率為56.00％，P<0.05，差異有顯著意義。Kaplan-Meier生存率曲線分析的結(jié)果顯示，VEGF-C陰性表達(dá)患者的累積生存率顯著高于VEGF-C

11、陽性表達(dá)患者，經(jīng)時(shí)序檢驗(yàn)差異有顯著意義(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]：
　　 本研究證明VEGF-C在食管癌組織中存在異常表達(dá)，且其異常表達(dá)參與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤及血管生成，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。上述研究結(jié)果提示VEGF-C基因異常表達(dá)可作為判斷食管鱗癌的惡性生物學(xué)行為及患者預(yù)后的重要指標(biāo)，并可能成為食管癌基因治療及抗腫瘤血管生成治療的新靶標(biāo)。
　　 第二部分構(gòu)建RNAi慢病毒載體系統(tǒng)并篩選有效靶點(diǎn)

12、r>　　 [方法]：
　　 VEGF-C RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iTLentiviral RNAi Expression System，構(gòu)建入門克隆和病毒包裝目的質(zhì)粒。RNA干擾慢病毒的生產(chǎn)和滴度測定：四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT的方式生產(chǎn)病毒，病毒功能滴度測定用轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)，分子滴度測定用定量PCR技術(shù)。進(jìn)行基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞株的篩選：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)EC109細(xì)胞后用Blasticidin篩

13、選，建立VEGF-C基因沉默細(xì)胞株和對照細(xì)胞株，進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　 [結(jié)果]：
　　 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RNA干擾專業(yè)設(shè)計(jì)軟件，針對目的基因VEGF-C靶基因序列設(shè)計(jì)三組shRNA干擾靶點(diǎn)序列，分別標(biāo)記為1＃/2＃/3＃，并構(gòu)建成為vshRNA重組載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR鑒定，和測序比對。結(jié)果顯示，三組shRNA重組載體被成功構(gòu)建并測序無誤。收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢

14、病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。采用Realtime PCR的方法檢測目的基因mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。通過熒光圖片可知目的細(xì)胞的病毒感染效率達(dá)到90％以上。三個(gè)靶點(diǎn)中，3＃靶點(diǎn)是RNAi的有效靶點(diǎn)。相對NC組，目的基因的表達(dá)水平下調(diào)約30％。比較高低MOI的數(shù)據(jù)可以看到，高M(jìn)OI時(shí)敲減的效果更好。并對VEGF-C-siRNA的合成和抑制表達(dá)效果進(jìn)行檢測。
　　 [結(jié)論]：
　　 通

15、過該部分實(shí)驗(yàn)，我們成功構(gòu)建了三組特異性shRNA慢病毒載體，RNAi慢病毒的包裝也同時(shí)完成，并在293T細(xì)胞中完成病毒包裝后的滴度標(biāo)定。我們又從三組重組載體中篩選出高效率的靶點(diǎn)，并明確不同MOI值的非特異的毒性差異，為下一步選用最高效率的重組載體對食管癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染提供了可靠的依據(jù)。另外我們也初步驗(yàn)證了VEGF-C-siRNA在EC109細(xì)胞中有明顯的抑制作用。
　　 第三部分RNA干擾目的細(xì)胞效果評定及干擾后細(xì)胞生物學(xué)行為的改

16、變
　　 [方法]：
　　 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的EC109細(xì)胞，病毒感染前一天將目的細(xì)胞分入6-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，感染當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別分別加入RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，感染5天后收集細(xì)胞，應(yīng)用CCK8、流式細(xì)胞儀研究VEGF-C對食管癌細(xì)胞株體外增殖能力、細(xì)胞周期和遷移能力的影響。用克隆形成實(shí)驗(yàn)印證VEGF-C的促增殖作用。用Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)研究VEG

17、F-C對食管癌細(xì)胞株體外侵襲能力的影響。
　　 [結(jié)果]：
　　 干擾組的細(xì)胞生長曲線較其它兩組細(xì)胞(空白對照組以及無意義序列重組載體組)出現(xiàn)明顯的壓低，同時(shí)細(xì)胞活力明顯降低，這一結(jié)果提示在VEGF-C基因被干擾后，食管癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，腫瘤細(xì)胞的生長能力被抑制。過表達(dá)VEGF-C可促進(jìn)食管癌細(xì)胞株體外增殖、遷移和細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制表達(dá)VEGF-C對于食管癌細(xì)胞株體外增殖、遷移和細(xì)胞周期的進(jìn)展有抑制作用。另外沉