鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II在血管緊張素II受體1型活化和信號傳遞中的作用研究.pdf

1、血管緊張素II(AngII)是重要的致心肌肥厚因子,它可以引起心臟的變時、變力效應(yīng)及引起細(xì)胞增殖等[1],這些作用大部分都是由AngII受體1型(AT1)來介導(dǎo)完成的。
　　 鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CaMK)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣調(diào)節(jié)蛋白,心臟中主要表達的異構(gòu)體為CaMKII。有研究發(fā)現(xiàn)在肥大心肌和衰竭心臟中,CaMKII的表達也是升高的[2]。那么,CaMKII是否存在于AngII-AT1信號通路上?
　　 我們通過一系列

2、的實驗證實,在經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達AT1和CaMKII的COS7細(xì)胞中,AngII可以引起p-ERK活性增高,且p-ERK活性增高程度較單轉(zhuǎn)染AT1質(zhì)粒的細(xì)胞為高;CaMKII與AT1可發(fā)生結(jié)合,但AngII、AT1受體拮抗劑(ARB)對此種結(jié)合無明顯影響。而CaMKII的無功能突變體DN不能傳遞AngII信號。提示CaMKII引起心肌肥大的作用與AngII經(jīng)AT1傳遞的信號通路只是部分相關(guān),而主要是通過其他未知的信號通路。
　　 總

3、實驗分為四個部分:
　　 第一部分建立表達AT1和CaMKII/DN的轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞
　　 AT1、CaMKII/DN表達質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。通過大腸桿菌JM109擴增、AMP篩選及試劑盒抽提得到相關(guān)質(zhì)粒,經(jīng)EcoRI+NotI內(nèi)切酶雙消化鑒定AT1,得到目的AT1片段約為1.1kb左右長度;EcoRI+BamHI內(nèi)切酶雙消化鑒定CaMKII/DN,得到1.8kb左右長度目的CaMKII/DN質(zhì)粒片段,表明擴增成功。通

4、過磷酸鹽鈣沉淀法將不同質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞內(nèi)。分別提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的胞膜蛋白及胞漿蛋白,免疫印跡法(WB)可測得AT1及其所帶的HA-tag、CaMKII及其所帶的Vs-tag;免疫熒光法(IF)可測得細(xì)胞表達AT1/HA、CaMKII/DN/V5,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未能測得相應(yīng)蛋白,表明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論:轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型成功建立。
　　 第二部分測定雙轉(zhuǎn)染后表達的AT1+CaMKII/DN對AngII的p-ERK反應(yīng)

5、性分別給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞以AngII刺激,WB測定隨時間變化胞內(nèi)p-ERK的改變。另給予單轉(zhuǎn)染AT1、CaMKII、DN的細(xì)胞以AngII刺激或ARB預(yù)處理后再AngII刺激,WB測定胞內(nèi)p-ERK的改變。結(jié)果:經(jīng)AngII刺激,轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII組于7min左右p-ERK活性達到最高峰,AT1+DN組在7min作用出現(xiàn)一個明顯的p-ERK活性抑制峰,經(jīng)給予ARB預(yù)處理后這種作用消失;單轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染AT1

6、組出現(xiàn)p-ERK活性升高并可被ARB消除的現(xiàn)象,陰性對照組、轉(zhuǎn)染CaMKII組和轉(zhuǎn)染DN組則無此現(xiàn)象。結(jié)論:AT1和AT1/CaMKII均可傳遞AngII的肥厚信號,DN及單純CaMKII不能傳遞AngII的肥厚信號。
　　 第三部分測定雙轉(zhuǎn)后表達的AT1和CaMKII/DN在AngII、ARB等處理下的結(jié)合情況
　　 給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞不同時間的AngII刺激,處理后提取膜蛋白,標(biāo)化濃度后行免疫共

7、沉淀(co-IP)測定AT1上結(jié)合的CaMKII/DN情況隨時間變化情況。然后進行分組實驗:不處理組(一)、單予AngII刺激組(II)、單予ARB組(R)、先ARB預(yù)處理后再給予AngII組(RII)。Co-IP+WB檢測AT1上結(jié)合的CaMKII量。統(tǒng)計分析最終WB條帶灰度值。結(jié)果:時間曲線顯示從0、1、3、5、7到10min時AT1上均有CaMKII結(jié)合,5-7min結(jié)合量最高;DN亦可結(jié)合AT1,但未發(fā)現(xiàn)結(jié)合量有隨時間的漸進性變

8、化。分組實驗中II、R及RII組較(一)組均無明顯差異。結(jié)論:AT1可與CaMKII/DN結(jié)合;AngII及ARB對AT1上結(jié)合的CaMKII量均不存在影響。
　　 第四部分測定雙轉(zhuǎn)后AT1和CaMKII/DN經(jīng)AngII、ARB等處理后在細(xì)胞內(nèi)的相對分布情況
　　 分別給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞以單純AngII、ARB預(yù)處理后AngII刺激等不同干預(yù),按IF方法進行目的蛋白標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡下觀察AT