綿羊BAD基因影常年發(fā)情性狀的功能研究.pdf

1、我國大部分綿羊為季節(jié)性發(fā)情品種，綿羊的季節(jié)性發(fā)情制約了養(yǎng)羊業(yè)生產效率。綿羊常年發(fā)情可以提高生產效率，促進養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展，因此了解常年發(fā)情的分子機制，對改變綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀及新品種培育具有重要作用。本課題組前期通過RNA-Seq篩選發(fā)現(xiàn)BAD基因是常年發(fā)情及季節(jié)性發(fā)情綿羊卵巢組織中的差異表達基因。為了驗證RNA-Seq結果，并探索BAD基因在綿羊發(fā)情啟動中的作用機制，本研究對BAD基因進行了功能鑒定。本研究以小尾寒羊卵巢上成熟卵泡為試驗材料

2、，用抽吸法分離卵泡顆粒細胞，構建適合綿羊卵泡顆粒細胞生長的培養(yǎng)體系，并用細胞免疫熒光技術檢測卵泡顆粒細胞上特異性表達的促卵泡刺激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)蛋白，鑒定顆粒細胞純度;設計合成有效的BAD-siRNA，轉染原代綿羊卵泡顆粒細胞，以沉默BAD基因，用熒光定量PCR技術、Western-blot和細胞免疫熒光方法檢測BAD基因在mRNA水平和蛋白水平的表達變化，用

3、放射免疫方法檢測顆粒細胞分泌孕酮和雌二醇的濃度變化。獲得以下結果:熒光定量PCR檢測表明BAD基因在綿羊不同情期卵巢中的表達與前期測序結果一致，在發(fā)情前期的表達量顯著高于(P＜0.05)發(fā)情期、發(fā)情間期和休情期。我們所獲得的原代綿羊卵泡顆粒細胞中FSHR陽性率高達98％，說明卵泡顆粒細胞純度較高。BAD-siRNA轉染顆粒細胞48小時后，熒光定量PCR檢測結果表明BAD基因在mRNA水平表達下降68.82％，Western-blot和細