綿羊Myostatin基因敲除及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、Myostatin(MSTN)又稱為GDF-8，屬TGF-β超家族，是一種主要在動物骨骼肌中特異性表達的肌肉生長負調(diào)控因子。Myostatin基因超量表達可以導致動物肌肉萎縮，而其突變則使動物產(chǎn)生雙肌現(xiàn)象。Myostatin基因敲除小鼠的體重比對照組提高30％，肌肉量增加一倍，但對生存和繁育并未產(chǎn)生負面影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Myostatin基因自發(fā)突變雙肌牛的存在，但人為敲除Myostatin基因的畜禽尚未成功建立。本試驗選用產(chǎn)仔率較高的中國

2、小尾寒羊為研究對象，從小尾寒羊基因組中擴增出4.6kb和0.8kbMyostatin基因片段，分別作為打靶載體的5’同源長臂和3’同源短臂，以載體pGEM-3Zf(-)為骨架，以Neo和EGFP為標記基因和報告基因，構(gòu)建了帶有雙篩選標記的無啟動子且無PolyA信號的綿羊Myostaitn基因打靶載體p3Zf-MSTN，并以小尾寒羊胎羊為材料分離并純化了小尾寒羊原代骨骼肌成肌細胞，為通過基因打靶獲得Myostatin基因第三外顯子部分序列

3、缺失的綿羊體細胞和利用體細胞克隆建立Myostatin敲除的綿羊模型提供了條件，為進一步在細胞和動物水平驗證Myostatin缺失與畜禽肌肉超常發(fā)育的關(guān)系和探索利用Myostatin基因敲除改良畜禽生長性能的可能性奠定了基礎(chǔ)。本試驗在打靶載體標記基因和報告基因的兩端引入了loxP序列，以期利用Cre/loxP系統(tǒng)去除篩選基因和報告基因，以排除篩選基因和報告基因?qū)yostatin功能研究的影響，也為生產(chǎn)能夠安全食用的綿羊新品種奠定基礎(chǔ)。

4、 相比于Myostatin的基因與蛋白結(jié)構(gòu)及其生物學功能而言，對Myostatin基因的轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控機制了解甚少。盡管綿羊Myostatin的cDNA序列已經(jīng)克隆，但其5’調(diào)控區(qū)序列仍然未知。為了更好地了解綿羊Myostatin基因5’調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能，深入研究綿羊Myostatin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，本試驗選用中國小尾寒羊為材料，克隆了包括1.211kbMyostatin啟動子(Pro)的1.517kb基因片段(GenBa

5、nk登錄號為AY918121)，并對一些重要的調(diào)控元件進行了鑒定。序列比較分析表明，綿羊1.211kb(注：以下簡稱1.2kb)Myostatin啟動子(AY918121)與山羊(AY827576)、牛(AJ438578)、豬(AY527153)、人(AX058992)和鼠(AY204900)啟動子的同源性分別為98.1％、95.8％、86.9％、80.2％和67.7％。MatInspecter分析表明1.2kb的綿羊Myostatin

6、啟動子區(qū)存在3個TATAbox、1個CAATbox和8個E-box。另外，也發(fā)現(xiàn)存在Octamer、API、Gri-1B、MEF2、MTBF、GRE和PRE等重要調(diào)控元件。對豬、牛、山羊和綿羊Myostatin基因5’啟動子區(qū)一些重要調(diào)控基元的比較表明，各種調(diào)控元件在數(shù)量和位置上既存在保守性，也存在變異性。 為了進一步鑒定以上調(diào)控元件，以EGFP為報告基因，構(gòu)建了各種長度的野生型MSTNProW-EGFP載體和一些調(diào)控元件突變后

7、的突變型MSTNProM-EGFP載體，通過轉(zhuǎn)染C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞系，對各種情況下EGFP的瞬時或穩(wěn)定表達進行了熒光強度定量分析。結(jié)果表明不含任何啟動子的pEGFP-N1(4.1kb)陰性對照質(zhì)粒載體幾乎沒有EGFP表達，而0.3～1.2kb的綿羊Myostatin啟動子都能不同程度地驅(qū)動EGFP在C2C12細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達，其中1.2kb片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性最高。然而將綿羊1.2kbMSTNProW-EGFP載體轉(zhuǎn)染綿羊成纖

8、維細胞后并未觀察到EGFP的表達，這一結(jié)果再次驗證了Myostatin轉(zhuǎn)錄和表達的肌肉特異性。綿羊1.2kb的Myostatin啟動子區(qū)多個E-box(E)元件的存在暗示了肌肉特異性調(diào)控元件E-box的重要性以及MRFs轉(zhuǎn)錄因子家族(如MyoD等)對綿羊Myostatin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性。突變分析表明E3、E4、E5和E7，尤其是E3、E5和E7，對綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有重要影響。E3、E4和E5非常鄰

9、近的序列位置暗示了它們可能是共同作用于相應的轉(zhuǎn)錄因子，以族的形式維持DNA-蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性。E3和E5同時突變或E3、E5和E7同時突變并未比單獨突變其中一個元件表現(xiàn)出顯著差異。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綿羊1.2kbMSTNProW-EGFP載體的C2C12細胞中EGFP表達的研究表明，細胞生長密度的增加可以反饋性抑制Myostatin的轉(zhuǎn)錄和表達，而且Myostatin在C2C12分化狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄和表達量比成肌狀態(tài)時顯著升高。然而，對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1

10、.2kbMSTNProE357M-EGFP(E3、E5和E7同時突變)載體的C2C12細胞，EGFP的轉(zhuǎn)錄和表達量并未表現(xiàn)出分化和生長狀態(tài)時的差別。這一結(jié)果暗示了MyoD可能是通過E-box引起Myostatin在C2C12分化和生長狀態(tài)時轉(zhuǎn)錄和表達差異的原因，因為MyoD是參與成肌分化的一個主要因素。突變分析表明靠近綿羊Myostatin啟動子序列第三個TATA-box上游的MEF2元件(MEF2-1)對綿羊1.2kbMyostati

11、n啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有顯著的增強效應，而利用MatInspecter分析的另外一個MEF2元件(MEF2-2)沒有產(chǎn)生預期的效應。另外，在我們的試驗中還鑒定了對綿羊Myostatin啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有顯著影響的另外一個肌肉特異性調(diào)控元件MTBF。GRE調(diào)控元件的突變使綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性顯著降低，一定劑量的糖皮質(zhì)激素(地塞米松)可以顯著增加綿羊1.2kb野生型Myostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性

12、，而對GRE元件突變后的Myostatin啟動子影響不顯著，暗示了糖皮質(zhì)激素可能通過作用于GRE元件促進綿羊Myostatin的轉(zhuǎn)錄和表達，進而抑制肌肉的發(fā)育。糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU-486能夠顯著抑制糖皮質(zhì)激素對綿羊1.2kb野生型Myostatin啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的促進效應，意味著糖皮質(zhì)激素和GRE調(diào)控元件的作用是通過糖皮質(zhì)激素受體介導的。PRE元件的突變或孕激素的添加均使綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性明顯