加州鱸Myostatin基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能的分析及抑制物Follistatin的研究.pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin)屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族(Transforming Growth Factor beta，TGF-β)成員，是脊椎動物肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一，其功能是抑制MyoD家族成員轉(zhuǎn)錄活性，負(fù)向調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。研究表明，抑制Myostatin基因的活性，能夠促進(jìn)肌肉的生長，提高動物的產(chǎn)肉量。本實驗通過對加州鱸(Micropterus salmoides)Myostatin基因的結(jié)構(gòu)、功能及抑制物Folli

2、statin的研究，探討魚類肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為培育快速生長的養(yǎng)殖品種提供理論依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。 本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)從加州鱸成魚肌肉總RNA中擴(kuò)增得到Myostatin cDNA序列，對其進(jìn)行了序列測定和分析，結(jié)果表明加州鱸MyostatincDNA總長2640 bp，其中開放閱讀框長為1134 bp，編碼377個氨基酸，含22個氨基酸的信號肽、N-端前肽、蛋白酶水解位點(RARR)和緊接其后109個氨基酸

3、的C端生物活性區(qū)。與GenBank中已知的條紋狼鱸、金頭鯛、斑馬魚、虹鱒、斑點叉尾鲴、人、豬、雞Myostatin序列相比較，核苷酸序列同源性為63％～94.4％，推導(dǎo)的氨基酸同源性為61.4％～96％，其中C端生物活性區(qū)氨基酸同源性為88.1％～100％，具有很高的保守性，高度的保守性反映了該基因受到了高度的進(jìn)化限制及功能的重要性。加州鱸Myostatin C端生物活性區(qū)含有9個半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基的數(shù)量和位置與其它脊椎動物的相

4、一致，表明它們在維持該蛋白活性中的重要作用。 為進(jìn)一步了解魚類Myostatin基因表達(dá)的調(diào)控方式，采用PCR和基因組步移技術(shù)獲得了加州鱸Myostatin的基因組DNA序列，該序列總長為5.64 kb，其中5'側(cè)翼序列長為1463 bp，3'側(cè)翼序列長為294 bp，轉(zhuǎn)錄區(qū)序列長為3.883 kb。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，長度分別為488 bp、371 bp、1779 bp、390 bp和855bp。每個內(nèi)含子

5、都以GT開頭，AG結(jié)尾，符合GT-AG法則。內(nèi)含子2中有一個8個CA重復(fù)的微衛(wèi)星位點。序列分析結(jié)果表明加州鱸Myostatin啟動子中含有2個TATA box、1個CANTbox、9個E-box和一些轉(zhuǎn)錄反應(yīng)調(diào)控元件(MEF2、SRF、APl、MTBF等)。通過對加州鱸與牛Myostatin基因啟動子中E-box的分布比較，推測E6是影響該基因表達(dá)最重要的一個反應(yīng)元件。 卵泡抑素(Follistatin)是Myostatin的抑

6、制蛋白，為探討Myostatin受抑制時對肌肉生長產(chǎn)生的作用，獲得Follistatin重組蛋白將有助于實驗的深入開展，為此采用：RT-PCR和RACE技術(shù)從加州鱸成魚卵巢總RNA中擴(kuò)增得到FollistatincDNA序列，全長為1444bp，其中開放閱讀框長為966 bp，編碼321個氨基酸，包括信號肽31個氨基酸，成熟肽290個氨基酸。將成熟肽cDNA插入表達(dá)載體pET-32a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAG