hEGF生物活性新型蠶絲材料的創(chuàng)制與研究.pdf

1、蠶絲作為一種紡織材料，因光澤柔和、吸濕保暖性好、易于加工、舒適度好且能通過印染輕松染色等優(yōu)點在服裝紡織行業(yè)享有美譽。同時，蠶絲作為一種理想的生物材料，因獨特的機械性能、良好的生物相容性、較強的環(huán)境穩(wěn)定性和可緩慢降解等特性，逐漸在醫(yī)學和生物組織工程領域嶄露頭角。然而，天然蠶絲仍舊存在染色牢固度差、易脫色、機械性能遠不及蜘蛛絲纖維、其醫(yī)學材料特性依舊滿足不了當前醫(yī)學組織工程研究需要等缺陷。為了改善天然蠶絲存在的上述缺陷，研究人員們建立了基于

2、piggyBac轉座子的家蠶絲腺特異啟動系統(tǒng)，探索利用轉基因家蠶創(chuàng)造具有新型功能蠶絲材料的可行性，例如通過在家蠶絲腺表達熒光蛋白，獲得在自然光下即可呈現(xiàn)綠色、紅色或橘色的轉基因彩色蠶絲;通過在絲腺表達外源蜘蛛絲蛋白或多肽，獲得機械性能增強的轉基因蠶絲;通過絲腺表達不同醫(yī)用目的的外源蛋白和多肽，獲得細胞粘連性、生物相容性或鈣離子吸附能力提高的具有特定新功能的轉基因醫(yī)學蠶絲材料。但是，利用上述方法獲得的蠶絲材料仍有不足，轉基因彩色蠶絲出現(xiàn)了

3、機械性能的下降，轉蜘蛛絲基因獲得的蠶絲機械性能增強不顯著，醫(yī)用蠶絲材料中表達的目的蛋白不具有生物學活性等。人表皮生長因子（human epidermal growth factor, hEGF）是廣泛存在于哺乳動物體內的一類多肽物質，能極強的促進各種表皮細胞的生長，在醫(yī)學上用于燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷以及角膜損傷的治療。為了探究能否利用家蠶絲腺特異啟動系統(tǒng)表達出具有生物學活性的hEGF，從而獲得具有hEGF生物學活性的蠶絲材料。我們基于本

4、研究團隊2010年獲得的絲素重鏈高效表達載體R3，構建了兩個不同絲腺特異表達載體通過轉基因擬期創(chuàng)制具有hEGF生物活性新型蠶絲材料。本研究主要內容包括：
　　⑴兩種hEGF-重鏈融合蛋白轉基因表達載體的構建。家蠶絲素重鏈表達載體R3，主要由絲素重鏈基因N端、C端序列以及中間融合表達的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因構成，在表達載體R3的基礎上，我們用hEGF基因將EGFP基因替換，構建了轉基因表達載體pBac{Fib-H P3-

5、hEGF-LBS;3×P3-DsRed}；在hEGF-重鏈融合蛋白能夠正常加工和分泌的前提下，將信號肽切割位點(Cs)下游的重鏈N端序列以及參與蛋白分泌的半胱氨酸(Cys)上游的重鏈C端序列盡數(shù)截去，構建了另一個轉基因表達載體pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}。
　?、苃EGF轉基因品系的建立和分子鑒定。通過家蠶顯微注射的方法，將hEGF-重鏈融合蛋白轉基因表達載體和輔助質粒pHA3P

6、IG共同導入家蠶實用品種871非滯育的G0代早期胚胎中，并利用體式熒光顯微鏡對回交產生的G1代蠶卵胚胎和蠶蛾眼部進行紅色熒光的篩選。將載體pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS;3×P3-DsRed}注射獲得的轉基因系命名為TSL-P;將載體pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}注射獲得的轉基因系命名為TSL-P(s)。其中TSL-P陽性率為11/60(18.3％)，TSL-P(s)陽性率

7、為7/31(22.6％)。通過Southernblotting和Inverse PCR對TSL-P和TSL-P(s)共18個陽性品系個體的外源基因片段插入拷貝數(shù)和位置進行統(tǒng)計，其中轉基因蠶繭中hEGF純蛋白含量最高的TSL-P-2和TSL-P(s)-7兩個品系都是單拷貝，分別插入在家蠶9號和8號染色體上。
　　⑶轉基因蠶繭中hEGF-重鏈融合蛋白的分子檢測。利用0.6 g mL-1LiSCN溶液溶解蠶繭、離心取上清獲得蠶絲蛋白樣品

8、，并通過SDS-PAGE和Western blotting對蠶絲蛋白樣品進行分析。結果表明:1、hEGF-重鏈融合蛋白均已在TSL-P和TSL-P(s)轉基因家蠶后部絲腺表達并參與蠶繭的形成，并且TSL-P轉基因蠶繭中hEGF蛋白含量的平均值(4.9％)遠大于TSL-P(s)(2.1％)，其中TSL-P-2和TSL-P(s)-7 hEGF純蛋白的含量最高，分別為16.7％和3.0％;2、hEGF-重鏈融合蛋白的實際分子質量，TSL-P大

9、于預測值，而TSL-P(s)與預測值大小一致，該結果表明TSL-P轉基因系融合蛋白可能存在磷酸化、甲基化等后期加工修飾過程，結合之前研究結果可以推斷出后期加工修飾的區(qū)域就是位于本研究中被截去的絲素重鏈C段序列。
　?、绒D基因蠶絲中hEGF生物學活性檢測。利用55℃堿液對轉基因蠶絲材料進行脫膠處理，并對脫膠后的蠶絲材料是否具有hEGF生物學活性進行檢測。將浸泡過脫膠蠶絲的細胞培養(yǎng)基用于人表皮成纖維細胞的培養(yǎng)，通過Brdu免疫熒光對細

10、胞分裂率進行分析;將相同質量和體積的脫膠繭片鋪在人表皮成纖維細胞表面進行共培養(yǎng)，5天后對細胞進行MTT增值分析。兩個實驗結果一致表明，TSL-P(s)轉基因蠶絲中的融合蛋白具有hEGF的生物學活性，可以促進人表皮成纖維細胞的分裂和增殖，而TSL-P轉基因系蠶繭中的融合蛋白幾乎沒有生物學活性。本研究利用家蠶絲素重鏈表達載體成功在蠶絲中表達了hEGF-重鏈融合蛋白，獲得一種具有hEGF生物學活性的轉基因蠶絲材料。該研究結果可以為轉基因技術在