安神方抗焦慮作用的療效觀察及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、進(jìn)入21世紀(jì)以來，隨著社會(huì)發(fā)展進(jìn)程的加快競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈，生活、學(xué)習(xí)、工作等壓力也隨之不斷加大，人們?cè)诓煌潭壬掀毡楦惺艿搅司駢毫?，?lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)指出，精神病學(xué)以及心理衛(wèi)生將越來越受到人們的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)在10種造成社會(huì)最沉重負(fù)擔(dān)的疾病中，精神疾病占了4種，精神疾病的總負(fù)擔(dān)占全部疾病負(fù)擔(dān)的1/4，精神醫(yī)學(xué)正在逐步受到醫(yī)學(xué)同行及社會(huì)的關(guān)注并被賦予新的認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)在人們對(duì)精神健康的關(guān)注也從以往的重型精神障礙逐漸向輕型轉(zhuǎn)變。
　　 焦

2、慮是精神障礙五大癥狀群中常見的一種，焦慮障礙作為神經(jīng)癥的一個(gè)獨(dú)立的亞型，其發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。焦慮障礙又稱焦慮癥，其主要有兩種臨床形式-廣泛性焦慮障礙和驚恐障礙。廣泛性焦慮障礙(generalizedanxietydisorder，GAD)又稱慢性焦慮癥，其主要表現(xiàn)為對(duì)實(shí)際并不存在的威脅或危險(xiǎn)以及身體健康過分的擔(dān)心、緊張和害怕，并伴有口干、胃腸不適、惡心、腹瀉、呼吸困難、心悸、尿頻尿急、男性陽痿、女性月經(jīng)不調(diào)、出汗、面色潮紅及肌肉

3、緊張、手顫、頭痛、坐立不安等癥狀，另外還伴有注意力不集中、記憶力減退、睡眠障礙等癥狀。
　　 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)文明的進(jìn)步，人們?cè)缫严藢?duì)精神疾病的狹隘誤解，正確的認(rèn)識(shí)使得人們對(duì)自我心理健康的關(guān)注程度有了較大提高，因覺察到自身焦慮癥狀而主動(dòng)就醫(yī)的人數(shù)越來越多，焦慮障礙已經(jīng)成為綜合醫(yī)院門診、心理咨詢和治療機(jī)構(gòu)中常見的一類疾病。越來越多患有焦慮癥狀的人群希望能夠得到及時(shí)、有效的診斷和治療，為此，全球各國(guó)醫(yī)務(wù)工作者正在積極開展對(duì)

4、焦慮障礙發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防治療方案等方面的研究。
　　 目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在對(duì)焦慮障礙的發(fā)病機(jī)制研究方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，藥物治療方面也已具備了較為完善的理論。臨床治療多采用以地西泮為代表的苯二氮卓類藥物和丁螺環(huán)酮等非苯二氮卓類藥物，前者在使用初期起效很快但常伴有嗜睡、便秘、肌松、記憶力減弱等副作用，后者雖副作用較少，但起效通常較慢，另外該類藥物由于容易形成依賴和耐受以及戒斷反應(yīng)等因素，故也在一定程度上限制了應(yīng)用。因此，尋找療效確切

5、、副作用小的抗焦慮藥物就成為了目前抗焦慮研究領(lǐng)域的重要課題。
　　 我們的課題研究首先通過收集查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，在學(xué)習(xí)借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)焦慮障礙的研究現(xiàn)狀之后，找到了焦慮障礙與中醫(yī)學(xué)情志病之間的相關(guān)性和共同點(diǎn)，并在總結(jié)了中醫(yī)學(xué)歷代、各學(xué)派學(xué)者對(duì)情志病的調(diào)治方法的基礎(chǔ)之上，在博士生導(dǎo)師、知名中醫(yī)陳寶田教授指導(dǎo)下，確立了清熱除焦、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、安神定志的治療原則，制定了安神方(ASF)的組方用藥。教授結(jié)合個(gè)人近50年臨床經(jīng)驗(yàn)，在安神方中配伍

6、運(yùn)用柴胡、酸棗仁、桂枝、龍骨、牡蠣等藥物，用于治療焦慮癥見焦躁易怒、胸脅脹悶、驚悸不安、失眠健忘、肢體困乏、口苦咽干、舌紅脈弦數(shù)的患者。此次研究通過觀察安神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的臨床療效、并進(jìn)一步通過動(dòng)物試驗(yàn)探討安神方治療焦慮障礙的藥效學(xué)及相關(guān)作用機(jī)制。旨在充分發(fā)揮祖國(guó)醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治這些優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)的同時(shí)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，更好的解釋其作用效果及機(jī)理，為更好的治療焦慮障礙探索鋪就出一條有效之路。
　　 一、安

7、神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的療效觀察
　　 1.目的:通過臨床觀察探討安神方治療廣泛性焦慮障礙(GAD)的臨床效果，觀察癥侯及臨床整體療效以及收集整理相關(guān)檢查所得的結(jié)果，客觀的評(píng)價(jià)安神方治療GAD的臨床療效。
　　 2.方法:
　　 2.1病例與分組:將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的120例GAD入組患者隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組60例;
　　 2.2用藥:治療組口服“安神方”（由南方醫(yī)院中藥房提供，方劑組成為:

8、柴胡25g，桂枝10g，黃芩10g，黨參15g，白芍15g，生龍骨30g，生牡蠣30g，炒棗仁15g，遠(yuǎn)志10g，夜交藤30g，甘草10g等），每日1劑，分2次，晨起空腹及晚睡前30min各服一次:對(duì)照組口服地西泮（由天津利生制藥股份有限公司提供，2.5g/片，100片/瓶）口服，1片/次，晨起空腹及晚睡前30min各服一次。兩組均以連續(xù)服藥4周為1個(gè)療程。治療期間不同用其他抗焦慮及鎮(zhèn)靜安眠藥。兩組均于診療中同時(shí)注意對(duì)患者進(jìn)行必要的心理

9、疏導(dǎo)，避免情緒波動(dòng)。
　　 2.3改變指標(biāo):分別于治療前及治療后1、2、4周末各進(jìn)行一次漢密爾頓焦慮量表(HAMA)評(píng)定。以HAMA減分率(T)作為療效評(píng)定指標(biāo)，T＝（治療前總分-治療后總分）/治療前總分×100％。T小于25％為無效，25％～49％為好轉(zhuǎn)，50％～75％為顯著好轉(zhuǎn)，大于75％為臨床痊愈;總有效率=（痊愈+顯著+好轉(zhuǎn)）/總例數(shù)×100％。
　　 2.4臨床整體療效、不良反應(yīng)及安全性判定:以漢密爾頓焦慮量表

10、(HAMA)和副反應(yīng)量表(TESS)評(píng)價(jià)療效和不良反應(yīng)及其程度。并于治療前后檢查:體溫，心率，血壓，呼吸:血、尿、便常規(guī);肝、腎功能;心電圖等項(xiàng)目，以此對(duì)兩組服藥后的不良反應(yīng)以及藥物的安全性進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。
　　 2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示。治療前后劑量資料比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);兩組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn):治療后組間癥候療效

11、比較采用協(xié)方差分析;等級(jí)資料分布情況采用秩和檢驗(yàn)及非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以P＜0.05作為有顯著性差異的界限。
　　 3.結(jié)果:治療4周后，兩組HAMA分值均較治療前有顯著差異（P均＜0.01），兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療組與對(duì)照組TESS量表評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.結(jié)論:初步確認(rèn)了安神方治療GAD安全、有效且不良反應(yīng)較小，值得進(jìn)

12、一步研究推廣。
　　 二、安神方抗焦慮作用的藥效學(xué)研究
　　 1.目的:選用大鼠高架十字迷宮試驗(yàn)?zāi)Ｐ?EPM)，觀察安神方的抗焦慮作用。
　　 2.方法:將60只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組（10只/組）:正常對(duì)照組、模型組、地西泮組(DZP)和安神方(ASF)高、中、低劑量組。采用慢性情緒應(yīng)激的方法建立焦慮大鼠模型，同時(shí)給予藥物干預(yù)，以國(guó)際公認(rèn)的高架十字迷宮試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行藥效行為學(xué)評(píng)價(jià)。正常對(duì)照組不接受任

13、何處理，自由飲水和攝食。其余各組定時(shí)喂水訓(xùn)練7天，之后開始應(yīng)激試驗(yàn)，在上述兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)給予不確定空瓶刺激，維持1天1次或2次，持續(xù)2周。在不確定空瓶刺激期間，地西泮組給予1mg/kg灌胃，模型組每天給予等容積生理鹽水，ASF高、中、低劑量組每天劑量分別為:40g/kg、20g/kg、10g/kg。于第21天，ASF組末次給藥2h、模型組及DZP組末次給藥0.5h后，進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)測(cè)定，大鼠均提前2h進(jìn)入測(cè)試實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境。

14、>　　 3.儀器:大鼠高架十字迷宮(EPM)采用國(guó)際通用的方法制作。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠進(jìn)入開臂的時(shí)間百分率（OT％）、次數(shù)百分率(OE％)均明顯減少;DZP組與ASF高、中、低劑量組大鼠進(jìn)入開臂的

15、時(shí)間百分率(OT％)、次數(shù)百分率(OE％)均較模型組顯著上升，其中以ASF中劑量組上升最明顯。
　　 6.結(jié)論:行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示:DZP組、ASF高、中、低劑量組同模型組比較，EPM中大鼠OE％和OT％值均升高(P＜0.05)，尤其是ASF中劑量組升高最明顯(P＜0.01)，其作用效果與DZP相當(dāng)，這進(jìn)一步證實(shí)了ASF對(duì)大鼠焦慮狀態(tài)的干預(yù)作用，而且以中劑量給藥干預(yù)效果最好。
　　 三、安神方抗焦慮作用的形態(tài)學(xué)及相關(guān)機(jī)制

16、研究
　　 1.目的:觀察安神方(ASF)的抗焦慮作用，并初步研究其機(jī)制。
　　 2.方法:①.將所取雄性Wistar大鼠隨機(jī)平均分為6組:正常對(duì)照組、模型組、DZP組和ASF高、中、低劑量組;
　　 ②.采用慢性情緒應(yīng)激的方法建立焦慮大鼠模型，同時(shí)給予藥物干預(yù)，以國(guó)際公認(rèn)的高架十字迷宮模型(EPM)試驗(yàn)對(duì)其行為學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià);
　　 ③.行為學(xué)觀察后，將正常對(duì)照組、模型組、DZP組及ASF高、中、低劑量組大

17、鼠立即麻醉處死、斷頭，于冰臺(tái)上剝離大鼠的海馬組織。
　　 ④.在光學(xué)顯微鏡下采用HE染色法觀察大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和膠質(zhì)細(xì)胞的增生情況;用尼氏染色法觀察神經(jīng)元受損和尼氏體的丟失情況。
　　 ⑤.用免疫組化法觀察ASF對(duì)焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)——γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的影響;
　　 ⑥.用Westernbolt法觀察ASF對(duì)焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)受體——GAB

18、A(A)受體(GABA(A)Rα1)和Glu受體(N-甲基-D-天冬氨酸受體1即NMDAR1)表達(dá)的影響;
　　 ⑦.用熒光定量PCR法觀察ASF對(duì)焦慮大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)受體——GABA(A)受體(GABA(A)Rα1)和Glu受體(N-甲基-D-天冬氨酸受體1即NMDAR1)基因表達(dá)的影響。
　　 3.儀器:MilliQS純水/超純水系統(tǒng)、6219型PH計(jì)、BCD-196DT冰箱、CR703恒溫振蕩器、SFG

19、-02B電熱恒溫干燥箱、TS-1脫色搖床、EoipseTi-s倒置顯微鏡、MI-22FOEGC微波爐、RF2000熒光檢測(cè)器、PHS-2C精密酸度計(jì)、Avanti30冷凍離心機(jī)、BA110S電子天平、TiThermocyclerRea-timepCR儀、CA-92-2垂直層流潔凈工作臺(tái)、DYCP水平電泳槽、DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、sigma3K30超速冷凍離心機(jī)、MX3005P熒光定量PCR儀及分析軟件MXPr04.01
　　

20、 4.試劑:PBS緩沖液(ph7.2-7.4)、高效切片石蠟、中性甲醛、無水酒精、二甲苯、濃鹽酸、蘇木精、伊紅染、中性樹脂、50ml離心管、普通玻片、蓋玻片、玻片盒、玻片架、谷氨酸(Glu)購(gòu)自美國(guó)SIGMA，公司批號(hào)分別為43907190;γ-氨基丁酸(GABA)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，公司批號(hào)116K5005;乙腈購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司;GABA(A)Ra1兔IgG多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)santacurz公司;N-甲基-D-天冬氨酸受

21、體1(NMDAR1)兔IgG多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)santacurz公司;2mlPCR熒光管購(gòu)自Axgen公司;Nalater:AMBION公司;2000bpDNALadder:廣州瑞真生物科技有限公司;焦碳酸二乙醋(DEPC)treatedwater:大連TaKaRa寶生物公司;Trizol:Invitrogen公司、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒:Takara公司、SyBrI熒光定量試劑盒購(gòu)自Genecopoeia公司、瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司，其

22、余試劑均為進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)分裝試劑。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.結(jié)果:
　　 ①.正常對(duì)照組:海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細(xì)胞排列整齊，層次緊密，尼氏體深染;模型組:海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)

23、明顯的病理變化，染色質(zhì)溶解，部分細(xì)胞脫失，胞體固縮呈多角形或不規(guī)則形，胞質(zhì)濃縮核膜界限不清，錐體細(xì)胞排列松散，細(xì)胞缺失，尼氏體淺染甚至溶解;DZP組:海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列比較整齊，少部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)病理變化，少部分細(xì)胞染色質(zhì)溶解，少部分胞體固縮呈不規(guī)則形，錐體細(xì)胞排列部分松散，錐體細(xì)胞與中劑量組相當(dāng)，細(xì)胞部分缺失;ASF低、中、高劑量組:海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列比較整齊，神經(jīng)細(xì)胞部分出現(xiàn)病理變化，部分細(xì)胞染色質(zhì)溶解，部分細(xì)胞脫失，胞

24、體固縮呈不規(guī)則形。其中中劑量組細(xì)胞形態(tài)修復(fù)最好，ASF低劑量組錐體細(xì)胞排列比較整齊，比模型組錐體細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞部分缺失，尼氏體淺染;ASF中劑量組錐體細(xì)胞排列比較整齊，錐體細(xì)胞與高劑量組相當(dāng)，細(xì)胞部分缺失，尼氏體染色較高劑量組深染，與DZP劑量組相當(dāng);ASF高劑量組錐體細(xì)胞排列比較整齊，比低劑量錐體細(xì)胞有所增多，細(xì)胞部分缺失，尼氏體淺染。
　　 ②.模型組大鼠海馬組織中Glu的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著上升，GABA的表達(dá)量明顯

25、下降;地西泮組和安神方中劑量組同模型組比較，大鼠海馬組織中Glu的表達(dá)量顯著降低和GABA的表達(dá)量明顯提高，安神方中劑量組與地西泮組比較差異不顯著;
　　 ③.模型組與正常對(duì)照組比較，GABA(A)受體表達(dá)減少，Glu受體表達(dá)增多;地西泮組和安神方高、中、低劑量組分別同模型組進(jìn)行比較，Glu受體的表達(dá)水平均降低，GABA(A)受體的表達(dá)水平均提高;安神方中劑量組與地西泮組比較無明顯差異。
　　 ④.模型組與正常對(duì)照組比較

26、，GABA(A)受體基因減少，Glu受體基因增多;地西泮組和安神方高、中、低劑量組分別同模型組進(jìn)行比較，Glu受體基因水平均降低，GABA(A)受體受體基因水平均提高;安神方中劑量組與地西泮組比較無明顯差異。
　　 7.結(jié)論:安神方具有抗焦慮的作用，具體表現(xiàn)在:
　　 ①可以修復(fù)焦慮模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬區(qū)出現(xiàn)的病理性變化;
　　 ②可以提高大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA的含量，降低Glu的含量;