CONPs對腎癌的治療作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、臨床上許多進展期腎癌患者已經(jīng)失去手術(shù)機會，接受手術(shù)的患者將近有三分之一會發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移。抗血管治療藥物是針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGFR)受體的較為有效的治療方法，抗血管藥物同時阻滯絡(luò)氨酸激酶受體(RTK)，目前腎癌治療一線靶向藥物中舒尼替尼最為常用。令人惋惜的是有將近五分之一的腎癌患者對抗血管治療不敏感，剩下的患者最終再接受一到多個療程之后也會發(fā)展為耐藥。許多患者因為中斷了舒尼替尼的治療最終導致快速的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，所以開發(fā)新型的抗腫瘤藥

2、物迫在眉睫。
　　隨著納米科技的快速發(fā)展，各種納米藥物的藥效學得到深入研究，其中一些甚至進入臨床試驗和臨床治療。在這些納米藥物中，無機納米藥物得到廣泛研究，其中一些也在臨床試驗中得到理想效果。四氧化三鐵納米粒已經(jīng)被美國FDA食品與藥品監(jiān)督局批準并認可應(yīng)用于貧血的治療。最近，四氧化三鐵納米粒顯示出抗巨噬細胞的效應(yīng)，這樣就有潛能應(yīng)用于腫瘤的生物免疫治療。而且，銀納米粒已經(jīng)在婦產(chǎn)科感染性疾病的治療中取得一定療效。其它無機納米藥物，例如:

3、納米氧化鋅和納米金，仍然有成為抗腫瘤藥物的很大潛藏價值。在我們的前期研究中，氧化亞銅納米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles，CONPs)展示出理想的抗腫瘤效果和很低的生物毒性。銅伴侶蛋白調(diào)節(jié)細胞內(nèi)銅離子轉(zhuǎn)運和劑量，在腫瘤的進展中也扮演了重要角色。納米藥物和銅伴侶蛋白相互作用的機制尚未得到深入研究。
　　目的:
　　明確CONPs如何左右腎癌細胞的生物學行為，并在腎癌在體動物模型的實驗中進行驗證。在藥效

4、學實驗陽性的基礎(chǔ)上，迸一步探討CONPs對抗腎癌進展的分子學機制，并尋找該藥物抑制腎癌生長并誘導其凋亡的靶點。
　　方法:
　　1、通過CCK8法評估CONPs作用于腎癌細胞后，其細胞活力和增殖效應(yīng)的變化，并通過TRANSWELL實驗檢測CONPs對腎癌細胞遷移和侵襲的影響，采用AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒在流式儀上對CONPs是否誘導腎癌細胞凋亡進行驗證。通過流式儀并利用Cell cycle stainin

5、g Kit檢測CONPs對腎癌細胞周期的效應(yīng)。
　　2、RNA提取和qRT-PCR檢測CONPs作用后腎癌細胞轉(zhuǎn)錄水平RNA變化情況，WB實驗在蛋白水平檢測CONPs對腎癌細胞蛋白質(zhì)翻譯有何影響，shRNA干擾靶蛋白尋找并驗證CONPs的靶點。
　　3、透射電子顯微鏡觀察CONPs作用于腎癌細胞器的亞細胞結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)銅離子含量通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法的銅總量吸收實驗所測定，通過對腎癌細胞內(nèi)ROS和鈣離子濃度的檢測來檢驗細胞

6、內(nèi)氧化活性反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活。
　　4、裸鼠皮下成瘤在體實驗驗證CONPs在動物體內(nèi)是否能發(fā)揮抗腎癌效應(yīng)。取裸鼠皮下瘤體標本TUNEL和KI67實驗，進一步在體內(nèi)實驗中驗證CONPs對腎癌增殖和凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1、CONPs對腎癌細胞生長產(chǎn)生抑制，并且阻滯腎癌細胞周期于S和G2期。同時，CONPs抑制了腎癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　2、透射電子顯微鏡觀察到CONPs使腎癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，并且用

7、流式細胞技術(shù)也檢測到CONPs使腎癌細胞內(nèi)ROS水平和鈣離子濃度顯著提高，并且與用藥濃度和用藥時間正相關(guān)，ROS水平和鈣離子濃度的上升都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的使動因素。
　　3、CONPs誘導細胞內(nèi)銅離子積聚，并且靶向作用銅伴侶蛋白發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。CONPs誘導腎癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促進其細胞凋亡，WB實驗驗證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和凋亡通路上關(guān)鍵蛋白的激活。
　　4、CONPs在體內(nèi)動物模型實驗中抑制裸鼠皮下腎癌瘤體的生長。并且靶向AXL和M

8、ET蛋白，恢復腎癌耐藥細胞對舒尼替尼的敏感性，體內(nèi)實驗的瘤體也同時驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和凋亡通路的激活，以及對耐藥蛋白的抑制。
　　結(jié)論:
　　我們系統(tǒng)性了CONPs的藥理學效應(yīng)，以及無機納米藥物在抑制腎癌和耐藥腎癌模型的進展，多項研究表明CONPs在體內(nèi)和體外實驗中抑制了腎癌的生長。并且我們研究了CONPs作用于銅伴侶蛋白ATOX1和CCS的藥理學效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)CONPs可以顯著影響ATOX1和CCS的功能，干擾細胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運，并且釋