下調miR-100對RGC-5的作用及相關機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　青光眼(glaucoma)造成永久性視神經傷害，嚴重損害視覺視功能，是迄今位于全球首位的不可逆性致盲眼病。青光眼的病理特征是病理性眼壓升高，視神經的凹陷性萎縮，導致發(fā)生進行性視野缺損。但目前關于青光眼的發(fā)病機制尚未闡明。目前認為其發(fā)病可能與機械壓迫損傷學說以及缺血學說有關。青光眼發(fā)病過程的重要危險因素是病理性眼壓升高，目前對青光眼治療的主要方法是利用藥物治療或手術治療降低眼壓，從而減緩青光眼的疾病發(fā)生發(fā)展進程

2、。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，部分青光眼患者的眼壓雖可降低至正常范圍內，但仍未阻斷視神經萎縮的進展，且視功能也持續(xù)性減退，因此應用藥物治療或其他干預措施對視神經的保護治療，抑制視網膜神經節(jié)細胞凋亡，或增加視網膜神經節(jié)細胞存活數目，延長其存活時間，是維持青光眼患者的視力，阻止視功能損傷的關鍵措施。
　　視神經的形成主要是由從視網膜各個方向延伸到視乳頭的視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的軸突纖維而形成

3、，視神經的視網膜神經節(jié)細胞向視覺中樞傳遞視覺信號，因此RGCs凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。因此研究青光眼等視神經損害疾病的發(fā)病機制主要圍繞RGCs細胞。對于視網膜神經節(jié)細胞的損傷機制研究認為可能有包括剝奪神經營養(yǎng)因子、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、以及氧自由基損傷等。而建立RGC-5細胞系并制備相關細胞凋亡模型是研究視網膜神經節(jié)細胞的損傷機制的關鍵。
　　高度保守的基因調節(jié)因子microRNA(miRNA)的出現(xiàn)為疾病診

4、斷、治療提供新的思路。miRNA主要以序列特異性的方式，通過轉錄后調控發(fā)揮作用，調節(jié)基因表達，對轉錄后水平的基因表達起抑制作用，參與細胞生長、增殖、分化、代謝及凋亡的調控。miRNA一般由19-25個核苷酸組成，長度為18-22 nt，前體微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的發(fā)夾狀前體，是幾百至幾千nt大小的初級產物，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生，pre-miRNA是miRNA的前身，轉運至細胞質，由RNA酶Ⅲ內切酶家族的Dice

5、r酶剪切前體微小RNA形成，從各自的pre-RNA的5'端釋放出來，成為18-22 nt的成熟的單鏈miRNA，發(fā)揮對靶mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與視網膜病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關。miRNAs可能與視網膜色素變性、視神經母細胞瘤以及視網膜新生血管化等都有關。microRNA-100(miR-100)是新近研究的MicroRNA成員，目前已發(fā)現(xiàn)其主要與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。目前已發(fā)現(xiàn)miR-100在

6、肝癌、肺癌、鼻咽癌、腎上腺皮質腫瘤等多種腫瘤中表達異常，促進腫瘤的發(fā)生或侵襲。但miR-100在青光眼等眼科疾病中的表達及其具體作用機制尚未完全闡明，因此本研究的目的是探討miR-100在RGC-5細胞凋亡發(fā)生的作用及機制。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)RGC-5細胞，分別加入不同濃度100μm、200μm、400μm、500μm、1000μm過氧化氫培養(yǎng)24h，制備氧化應激損傷模型;MTT法和TUNEL法檢測RGC-5細胞凋亡

7、情況;使用Real time PCR檢測miR-100在正常和不同濃度(100u、200μm、400μm、500μm、1000μm)過氧化氫氧化應激損傷模型中的表達。
　　2、選取400μm濃度過氧化氫制作氧化應激模型，利用慢病毒轉染miR-100抑制劑，檢測抑制miR-100后對RGC-5細胞凋亡情況的保護作用;MTT法和TUNEL染色觀察細胞凋亡情況;并用免疫組化分析抑制miR-100后對氧化應激損傷的RGC-5軸突長度的影響

8、。3、Western blot分析miR-100對RGC-5細胞的作用機制;使用熒光素酶活性實驗檢測miR-100與GIF1R基因3'UTR的靶向調節(jié)作用;使用siRNA轉染IGF1R蛋白后，用TUNEL法檢測RGC-5細胞凋亡情況;使用Westem blot分析上述過程。
　　結果:
　　1、過氧化氫所造成的氧化應激損傷，使RGC-5細胞的凋亡率顯著增加，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;且過氧化氫造成

9、的氧化應激損傷導致的RGC-5細胞的凋亡率具有濃度依賴性。不論是正常RGC-5細胞還是氧化應激損傷的細胞模型中，均可檢測到miR-100的表達。但在正常RGC-5細胞中，miR-100含量非常少，而與正常細胞的miR-100表達比較，可見不同濃度過氧化氫作用的RGC-5細胞中miR-100均呈表達上調，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著過氧化氫作用濃度的增加，RGC-5細胞中miR-100表達進一步增加。

10、>　　2、轉染miR-100抑制劑后，可顯著降低氧化應激損傷的RGC-5細胞中miR-100的表達，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。氧化損傷模型中，在轉染miR-100抑制劑有效抑制miR-100表達后，RGC-5細胞中TUNEL染色陽性細胞明顯減少，RGC-5細胞凋亡率明顯降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉染miR-100抑制劑后，因氧化應激損傷導致變圓腫脹的細胞變得細長，形態(tài)與正常RGC-5

11、細胞相似，RGC-5細胞軸突長度明顯增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、轉染miR-100抑制劑后，磷酸化的TrkB、磷酸化的AKT、磷酸化的ERK1/2蛋白表達增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。miR-100靶向結合IGF1R的3'UTR，IGF1R3'UTR熒光素活性明顯降低，且這種活性降低主要見于野生型IGF1R，突變型IGF1R并未見明顯變化，與對照組以及突變型IGF1R

12、比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。siRNA干擾IGF1R后，使IGF1R表達減少或抑制，RGC-5 TUNEL染色陽性的細胞明顯減少，其磷酸化的AKT表達增加。
　　結論:
　　1.過氧化氫作用RGC-5細胞造成氧化應激損傷，可誘導RGC-5細胞凋亡，且呈濃度依賴性。
　　2.miR-100在正常和氧化應激損傷的RGC-5細胞中均表達，且隨著氧化應激損傷程度增加而表達上調，呈濃度依賴性，說明與RGC-5細胞凋