下調(diào)miR-100對RGC-5的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　青光眼(glaucoma)造成永久性視神經(jīng)傷害，嚴(yán)重?fù)p害視覺視功能，是迄今位于全球首位的不可逆性致盲眼病。青光眼的病理特征是病理性眼壓升高，視神經(jīng)的凹陷性萎縮，導(dǎo)致發(fā)生進(jìn)行性視野缺損。但目前關(guān)于青光眼的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為其發(fā)病可能與機(jī)械壓迫損傷學(xué)說以及缺血學(xué)說有關(guān)。青光眼發(fā)病過程的重要危險因素是病理性眼壓升高，目前對青光眼治療的主要方法是利用藥物治療或手術(shù)治療降低眼壓，從而減緩青光眼的疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程

2、。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，部分青光眼患者的眼壓雖可降低至正常范圍內(nèi)，但仍未阻斷視神經(jīng)萎縮的進(jìn)展，且視功能也持續(xù)性減退，因此應(yīng)用藥物治療或其他干預(yù)措施對視神經(jīng)的保護(hù)治療，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，或增加視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)目，延長其存活時間，是維持青光眼患者的視力，阻止視功能損傷的關(guān)鍵措施。
　　視神經(jīng)的形成主要是由從視網(wǎng)膜各個方向延伸到視乳頭的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的軸突纖維而形成

3、，視神經(jīng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向視覺中樞傳遞視覺信號，因此RGCs凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。因此研究青光眼等視神經(jīng)損害疾病的發(fā)病機(jī)制主要圍繞RGCs細(xì)胞。對于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制研究認(rèn)為可能有包括剝奪神經(jīng)營養(yǎng)因子、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、以及氧自由基損傷等。而建立RGC-5細(xì)胞系并制備相關(guān)細(xì)胞凋亡模型是研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制的關(guān)鍵。
　　高度保守的基因調(diào)節(jié)因子microRNA(miRNA)的出現(xiàn)為疾病診

4、斷、治療提供新的思路。miRNA主要以序列特異性的方式，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，對轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)起抑制作用，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、代謝及凋亡的調(diào)控。miRNA一般由19-25個核苷酸組成，長度為18-22 nt，前體微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的發(fā)夾狀前體，是幾百至幾千nt大小的初級產(chǎn)物，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，pre-miRNA是miRNA的前身，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，由RNA酶Ⅲ內(nèi)切酶家族的Dice

5、r酶剪切前體微小RNA形成，從各自的pre-RNA的5'端釋放出來，成為18-22 nt的成熟的單鏈miRNA，發(fā)揮對靶mRNA降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs可能與視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及視網(wǎng)膜新生血管化等都有關(guān)。microRNA-100(miR-100)是新近研究的MicroRNA成員，目前已發(fā)現(xiàn)其主要與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。目前已發(fā)現(xiàn)miR-100在

6、肝癌、肺癌、鼻咽癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生或侵襲。但miR-100在青光眼等眼科疾病中的表達(dá)及其具體作用機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究的目的是探討miR-100在RGC-5細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，分別加入不同濃度100μm、200μm、400μm、500μm、1000μm過氧化氫培養(yǎng)24h，制備氧化應(yīng)激損傷模型;MTT法和TUNEL法檢測RGC-5細(xì)胞凋亡

7、情況;使用Real time PCR檢測miR-100在正常和不同濃度(100u、200μm、400μm、500μm、1000μm)過氧化氫氧化應(yīng)激損傷模型中的表達(dá)。
　　2、選取400μm濃度過氧化氫制作氧化應(yīng)激模型，利用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑，檢測抑制miR-100后對RGC-5細(xì)胞凋亡情況的保護(hù)作用;MTT法和TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況;并用免疫組化分析抑制miR-100后對氧化應(yīng)激損傷的RGC-5軸突長度的影響

8、。3、Western blot分析miR-100對RGC-5細(xì)胞的作用機(jī)制;使用熒光素酶活性實驗檢測miR-100與GIF1R基因3'UTR的靶向調(diào)節(jié)作用;使用siRNA轉(zhuǎn)染IGF1R蛋白后，用TUNEL法檢測RGC-5細(xì)胞凋亡情況;使用Westem blot分析上述過程。
　　結(jié)果:
　　1、過氧化氫所造成的氧化應(yīng)激損傷，使RGC-5細(xì)胞的凋亡率顯著增加，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;且過氧化氫造成

9、的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞的凋亡率具有濃度依賴性。不論是正常RGC-5細(xì)胞還是氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型中，均可檢測到miR-100的表達(dá)。但在正常RGC-5細(xì)胞中，miR-100含量非常少，而與正常細(xì)胞的miR-100表達(dá)比較，可見不同濃度過氧化氫作用的RGC-5細(xì)胞中miR-100均呈表達(dá)上調(diào)，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著過氧化氫作用濃度的增加，RGC-5細(xì)胞中miR-100表達(dá)進(jìn)一步增加。

10、>　　2、轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后，可顯著降低氧化應(yīng)激損傷的RGC-5細(xì)胞中miR-100的表達(dá)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。氧化損傷模型中，在轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑有效抑制miR-100表達(dá)后，RGC-5細(xì)胞中TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯減少，RGC-5細(xì)胞凋亡率明顯降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后，因氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致變圓腫脹的細(xì)胞變得細(xì)長，形態(tài)與正常RGC-5

11、細(xì)胞相似，RGC-5細(xì)胞軸突長度明顯增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、轉(zhuǎn)染miR-100抑制劑后，磷酸化的TrkB、磷酸化的AKT、磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。miR-100靶向結(jié)合IGF1R的3'UTR，IGF1R3'UTR熒光素活性明顯降低，且這種活性降低主要見于野生型IGF1R，突變型IGF1R并未見明顯變化，與對照組以及突變型IGF1R

12、比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。siRNA干擾IGF1R后，使IGF1R表達(dá)減少或抑制，RGC-5 TUNEL染色陽性的細(xì)胞明顯減少，其磷酸化的AKT表達(dá)增加。
　　結(jié)論:
　　1.過氧化氫作用RGC-5細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷，可誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。
　　2.miR-100在正常和氧化應(yīng)激損傷的RGC-5細(xì)胞中均表達(dá)，且隨著氧化應(yīng)激損傷程度增加而表達(dá)上調(diào)，呈濃度依賴性，說明與RGC-5細(xì)胞凋