Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機制.pdf

1、目的:
　　 視神經(jīng)損傷是目前許多臨床眼部疾病和外傷治療的難點。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)的丟失及再生困難，是視神經(jīng)損傷導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素，如何進行有效的逆轉(zhuǎn)治療一直是眼科和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域面臨的難題之一。Neuritin又名可塑性相關(guān)候選基因15(candidate plasticity-related gene15，CPG15)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的新成員。Neuri

2、tin主要表達于神經(jīng)系統(tǒng)中，Neuritin是神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)活動發(fā)揮作用的共同下游因子，在抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進軸突生長、促進突觸成熟和調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面均具有重要作用。
　　 本實驗基于Neuritin獨特的神經(jīng)營養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的變化和作用，研究視神經(jīng)損傷后Neuritin基因在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達變化，并以Neuritin為靶進行治療，推測其對RGCs的存活和再生這一視神經(jīng)損傷和疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有明顯的

3、作用，將有助于進一步揭示視神經(jīng)再生難的原因和探討視神經(jīng)修復(fù)的新方法。
　　 方法:
　　 (1)視神經(jīng)夾傷模型的制作:用Yasargil腦動脈瘤夾于成年雄性大鼠視神經(jīng)眼球后約1 mm處夾傷9 s，模擬臨床造成視神經(jīng)不完全損傷。采用HE染色、CTB追蹤、透射電鏡觀察等方法觀察視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的形態(tài)變化。
　　 (2)觀察Neuritin在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時空表達變化:應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測Neu

4、ritin在組織細胞中的定位，再分別應(yīng)用Western blot和Real time PCR的方法檢測視神經(jīng)損傷后Neuritin在蛋白和mRNA水平的表達變化。
　　 (3)構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒并包裝測定其滴度。
　　 (4)體內(nèi)觀察Neuritin過表達對受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用:大鼠視神經(jīng)夾傷前1周玻璃體注射Neuritin慢病毒，損傷2周后采用CTB順行標(biāo)記RGCs以觀察其存活及軸突的再生情況。<

5、br>　　 (5)體外觀察Neuritin蛋白或過表達對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系(Retinal GanglionCell-5，RGC5)的作用及機制:采用CCK8法或MTT法檢測Neuritin蛋白對受損RGC5存活的影響，相差顯微鏡拍照觀察Neuritin過表達對RGC5突起長度的影響，DAPI染色和Western blot方法分別檢測Neuritin對RGC5細胞凋亡的影響:進一步通過Western blot檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)信號通

6、路關(guān)鍵分子pSTAT3、pAKT和pERK的表達。
　　 結(jié)果:
　　 (1)正常視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中Neuritin蛋白的表達定位:免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中Neuritin蛋白主要表達于RGCs胞體和突起及部分星形膠質(zhì)細胞中;正常視神經(jīng)中Neuritin蛋白主要表達于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞中。
　　 (2)成功建立視神經(jīng)不完全損傷模型:HE染色結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后損傷區(qū)神經(jīng)外膜保持完整

7、，CTB追蹤結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后遠側(cè)端仍保留有正常運輸功能的軸突，透射電鏡結(jié)果顯示視交叉前段視神經(jīng)仍保留有正常樣軸突。
　　 (3)視神經(jīng)受損后Neuritin在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時空表達變化規(guī)律:Westernblot顯示視神經(jīng)受損后1 d Neuritin蛋白在視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中表達升高，傷后3d、7d均高表達，其后緩慢下調(diào)至正常水平，Real time PCR的結(jié)果顯示傷后1 d NeuritinmRNA瞬時表達高表達，其后下

8、調(diào)至或低于正常水平。
　　 (4)成功構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒，并獲得高滴度的Neuritin慢病毒顆粒。
　　 (5)體內(nèi)Neuritin過表達對受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用:損傷后2周Neuritin過表達組RGCs的存活明顯增加，存留及再生的軸突顯著增多。
　　 (6)體外Neuritin蛋白及過表達對RGC5的作用及機制:CCK8法結(jié)果顯示重組的人Neuritin蛋白可增加受損RGC5的存活，Ne

9、uritin過表達可增加RGC5最長突起的長度;DAPI染色及Caspase3表達的檢測顯示Neuritin過表達可以減少受損RGC5細胞的凋亡及活化型Caspase3的表達。神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)信號通路的檢測顯示Neuritin過表達可下調(diào)pSTAT3蛋白的表達，并上調(diào)pAKT和pERK蛋白的表達。
　　 結(jié)論:
　　 (1) Neuritin在正常視網(wǎng)膜中主要表達于RGCs及部分星形膠質(zhì)細胞中，在視神經(jīng)中主要表達于RGC

10、s軸突、少突膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞。
　　 (2)采用Yasagil腦動脈瘤夾夾傷視神經(jīng)，可建立視神經(jīng)不完全損傷模型。
　　 (3)視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)Neuritin的高表達，而后期Neuritin表達的不足提示可能為RGCs大量死亡和軸突再生失敗的原因之一。
　　 (4)體內(nèi)實驗初步證實Neuritin過表達對視神經(jīng)損傷后的RGCs有保護作用，可以有效促進RGCs的存活及其軸突的再生。