鐵過載對(duì)骨代謝的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分高鐵和低鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性影響的比較研究
　　目的：觀察成骨細(xì)胞(hFOB1.19)在高鐵環(huán)境、低鐵環(huán)境培養(yǎng)后，細(xì)胞生物活性指標(biāo)的變化趨勢，比較兩種培養(yǎng)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　方法：成骨細(xì)胞(hFOB1.19)常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度枸櫞酸鐵銨(FAC)構(gòu)成高鐵培養(yǎng)環(huán)境；同樣，分別加入5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L去鐵

2、胺(DFO)構(gòu)成低鐵培養(yǎng)環(huán)境。各組培養(yǎng)不同時(shí)間后，檢測成骨細(xì)胞生物活性指標(biāo)：細(xì)胞內(nèi)的鐵離子、細(xì)胞增殖活性、堿性磷酸酶活性、細(xì)胞凋亡、鈣結(jié)節(jié)染色、Ⅰ型膠原(COL1)和骨鈣素(OC)的基因及蛋白表達(dá)。對(duì)照組加入去離子水。
　　結(jié)果：在FAC組，隨FAC的濃度增加，細(xì)胞內(nèi)的鐵離子逐漸增加，成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化、Ⅰ型膠原(COL1)和骨鈣素(OC)的基因和蛋白表達(dá)指標(biāo)呈劑量依賴性減低；在DFO組，隨DFO的濃度增加，細(xì)胞內(nèi)的鐵離子逐

3、漸減少，小劑量的DFO可促進(jìn)成骨細(xì)胞上述生物活性指標(biāo)，大劑量的DFO則抑制上述指標(biāo)。
　　結(jié)論：高鐵培養(yǎng)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性具有抑制作用，呈劑量依賴性，低鐵培養(yǎng)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性存在雙重劑量效應(yīng)：適當(dāng)?shù)牡丸F環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性具有促進(jìn)作用，但嚴(yán)重的低鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性也具有一定的抑制作用。一定范圍的鐵濃度可使成骨細(xì)胞生物活性達(dá)到最佳狀態(tài)。
　　第二部分高鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性影響的相關(guān)機(jī)制研究
　　目的

4、：研究高鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物活性作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：34℃條件下體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞(hFOB1.19)，以不同濃度(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)枸櫞酸鐵銨(FAC)干預(yù)，用RT-PCR檢測成骨細(xì)胞鐵調(diào)節(jié)基因膜轉(zhuǎn)鐵蛋白1(FPN1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(DMT1)的表達(dá)變化；流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞活性氧(ROS)水平；丙二醛(Maleic Dialdehyde，MDA)、

5、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase， SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒檢測成骨細(xì)胞MDA含量及SOD、GSH-PX活性；為進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激在其中的意義，同時(shí)用2.5mmol/L抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)，再次用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平，CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力，RT-PCR法檢測各組細(xì)胞OPG、OC和COL1 m

6、RNA表達(dá)的變化，堿性磷酸酶活性試劑盒檢測各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性。
　　結(jié)果：FAC干預(yù)后，F(xiàn)PN1 mRNA的表達(dá)隨FAC干預(yù)濃度增加呈劑量依賴性上調(diào)，TfR、DMT1 mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)（P<0.05）；成骨細(xì)胞ROS水平隨FAC干預(yù)濃度增加呈劑量依賴性升高（P<0.05）；成骨細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物MDA水平呈劑量依賴性升高，成骨細(xì)胞抗氧化物酶 SOD及 GSH-PX活性呈劑量依賴性降低（P<0.05）；進(jìn)一步加入NA

7、C后分組觀察，不同干預(yù)組成骨細(xì)胞內(nèi)活性氧含量差異顯著不同（P<0.05），F(xiàn)AC組顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)AC+NAC組低于 FAC組、高于 NAC組；各組間活性氧含量的變化與成骨細(xì)胞活力、OPG、OC和COL1 mRNA表達(dá)、堿性磷酸酶活性呈負(fù)相關(guān)性，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：鐵過載對(duì)成骨細(xì)胞生物活性有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度增加后導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
　　第三部分高鐵環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞

8、和破骨細(xì)胞分化的影響
　　目的：了解高鐵培養(yǎng)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的影響。
　　方法：37℃條件下體外培養(yǎng)以小鼠前成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，在10mmol/lβ-甘油磷酸和50μg/ml抗壞血酸的誘導(dǎo)分化的作用下，分化為成骨細(xì)胞，同時(shí)用不同濃度(50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l)枸櫞酸鐵銨(FAC)干預(yù)，用RT-PCR檢測成骨細(xì)胞分化基因成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Ost

9、errix)、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨鈣素(OC)的表達(dá)，堿性磷酸酶活性試劑盒檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性；37℃條件下體外培養(yǎng)以小鼠單核細(xì)胞 RAW264.7，在20ng/ml核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的誘導(dǎo)分化的作用下，分化為破骨細(xì)胞，同時(shí)用不同濃度(12μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)枸櫞酸鐵銨(FAC)干預(yù)，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)觀察TRAP陽性細(xì)胞形成情況并計(jì)數(shù)

10、，RT-PCR檢測破骨細(xì)胞分化基因抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶 K(CTK）和金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)。
　　結(jié)果：成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)隨FAC干預(yù)濃度的增加呈劑量依賴性下調(diào)(P<0.05)，成骨細(xì)胞ALP水平隨FAC干預(yù)濃度的增加呈劑量依賴性降低(P<0.05)。TRAP陽性細(xì)胞的數(shù)量隨FAC干預(yù)濃度的增加而增加(P<0.05)，破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)隨FAC干預(yù)濃度的增加呈劑量依賴性上調(diào)(P<

11、0.05)。
　　結(jié)論：高鐵培養(yǎng)環(huán)境明顯抑制小鼠前成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化，明顯促進(jìn)小鼠單核細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化。
　　第四部分鐵過載對(duì)去勢大鼠骨代謝的影響
　　目的：觀察高鐵干預(yù)后去勢大鼠體內(nèi)鐵代謝與骨代謝的變化，探討鐵過載對(duì)去勢大鼠骨代謝的影響。
　　方法：將32只3月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、去勢組(OVX)、OVX+FAC低劑量組(FAC1)、OVX+FAC

12、中劑量組(FAC2)和 OVX+FAC高劑量組(FAC3)。去勢后1周，F(xiàn)AC1、FAC2和FAC3組分別按45、90、180mg/kg腹腔注射，每周2次，OVX組和 Sham組按同樣方式和頻次給予等量生理鹽水。干預(yù)9周后處死取材，生化法測血清鐵離子含量，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP法測定大鼠左側(cè)脛骨鐵含量, Perl’s法對(duì)肝臟切片進(jìn)行鐵染色觀察, Micro-CT對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行三維圖像分析，骨組織切片行HE染色觀察，酶聯(lián)免疫吸附

13、法（ELISA）測定血清β-Ⅰ型膠原羧基端肽(β-CTX)和骨鈣素(BGP)的含量。
　　結(jié)果：與Sham組比較，OVX組血清鐵和脛骨鐵含量明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，F(xiàn)AC1組、FAC2組和FAC3組血清和脛骨鐵隨FAC干預(yù)濃度的增加明顯升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；FAC1組、FAC2組和FAC3組肝臟染色明顯可見藍(lán)染鐵顆粒；Micro-CT結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組骨小梁變疏松，F(xiàn)AC1

14、組、FAC2組和FAC3組隨FAC干預(yù)濃度的增加骨小梁更加疏松、連續(xù)性下降，空隙率增加；骨組織病理切片染色顯示Sham組大鼠骨小梁飽滿，形態(tài)結(jié)果完整，排列緊密有序成網(wǎng)狀；OVX組骨小梁較為稀疏，小梁間隙增大；FAC1組、FAC2組和FAC3組隨FAC干預(yù)濃度的增加骨小梁更加稀疏，變細(xì)、變薄，有扭曲或斷裂；ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，OVX組、FAC1組、FAC2組和FAC3組BGP和CTX的水平均明顯升高（P<0.05），但B