不同軀體應(yīng)激對(duì)大鼠腦鐵代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn),在一些神經(jīng)變性性疾病,例如:AD、PD、亨廷頓舞蹈病中,病人腦內(nèi)出現(xiàn)鐵的重新分布和部分腦區(qū)的鐵沉積。研究也表明,腦內(nèi)高鐵和可能存在的腦內(nèi)抗氧化防御機(jī)制缺陷所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與這些神經(jīng)變性性疾病中的神經(jīng)元死亡密切相關(guān)。但是腦內(nèi)出現(xiàn)鐵重新分布和沉積的機(jī)制尚未闡明。 以往的研究表明：某些軀體應(yīng)激(熱應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)應(yīng)激、暈船)狀態(tài)下,動(dòng)物腦內(nèi)可出現(xiàn)鐵含量的變化。本課題組前期的一些實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。上述現(xiàn)象提示我們：軀體應(yīng)激可能

2、會(huì)引起腦內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失去平衡。為了驗(yàn)證這一想法,我們需要明確不同應(yīng)激源暴露對(duì)大鼠腦鐵代謝的影響,并且初步探討軀體應(yīng)激影響大鼠腦鐵代謝的機(jī)制。通過這些實(shí)驗(yàn),為探索臨床上以腦鐵代謝紊亂為主要病理改變的一些疾病(如神經(jīng)變性性疾病)的治療方法提供新的線索。為此,我們進(jìn)行了如下研究。 第一部分：不同軀體應(yīng)激對(duì)大鼠腦鐵含量的影響 目的：觀察不同軀體應(yīng)激源暴露對(duì)大鼠全腦和各腦區(qū)鐵含量的影響。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3、2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 3.原子吸收分光光度法測(cè)定大鼠全腦及各腦區(qū)鐵含量 結(jié)果: 1.與對(duì)照組相比,各應(yīng)激組大鼠全腦鐵含量均無顯著變化；各應(yīng)激組間大鼠全腦鐵含量無顯著差異。 2.與對(duì)照組相比,足底電擊組、水浸束縛組和截肢創(chuàng)傷組大鼠大腦前額皮質(zhì)內(nèi)鐵含量分別增加1137.1％、34.5％和25.3％(P<0.05),三組之間無顯著差異；海馬內(nèi)鐵含量分別增加58.3％、77.4％和95.2％(P<0.05);紋狀體內(nèi)

4、鐵含量分別增加70.7％、75.2％和61.2％(P<0.05);小腦和腦干內(nèi)鐵含量無顯著變化。三個(gè)應(yīng)激組間大鼠相應(yīng)腦區(qū)鐵含量均無顯著差異。 第二部分:軀體應(yīng)激對(duì)大鼠腦鐵攝取和儲(chǔ)存蛋白的影響 目的:研究軀體應(yīng)激對(duì)大鼠腦鐵攝取和儲(chǔ)存蛋白的影響,初步闡釋軀體應(yīng)激條件下大鼠腦鐵穩(wěn)態(tài)失衡的原因。 方法: 1.動(dòng)物模型 2.ELISA法測(cè)定海馬內(nèi)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferring recepto

5、r,TfR)含量 3.Western blot法測(cè)定海馬鐵蛋白、TfR、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metaltransporter 1,DMTl)和乳鐵蛋白(1actoferrin,Lf) 結(jié)果: 1.ELISA:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足底電擊組大鼠海馬內(nèi)鐵蛋白含量降低57.4％,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量升高75.0％(P<0.05)。 2.Westem blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足底電擊

6、組大鼠海馬內(nèi)鐵蛋白表達(dá)減少,TfR表達(dá)增加(P<0.05),DMT1(有或無IRE型)和Lf蛋白量無顯著變化。 第三部分：軀體應(yīng)激對(duì)大鼠腦鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory propteins,IRPs)的影響 目的：在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平測(cè)定IRPPs基因表達(dá)情況,初步探討軀體應(yīng)激條件下大鼠腦鐵攝取和儲(chǔ)存機(jī)制變化的原因。 方法： 1.動(dòng)物模型 2.Real-time PCR法測(cè)定IRP1和IR

7、P2的mRNA含量 3.Western blot法測(cè)定海馬內(nèi)IRP1：取含50ug蛋白的海馬裂解液經(jīng)10％非變性SDS-PAGE電泳分離后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用麗春紅染色,以證實(shí)蛋白質(zhì)已轉(zhuǎn)移至膜上。膜用脫脂奶粉室溫封閉2 h后,與1:1000兔抗大IRP1體和1:1000的B-actin抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜3次后,與1:5000辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。用ECL檢測(cè)試劑檢測(cè)膜上蛋白質(zhì),并用ImageJ軟

8、件進(jìn)行條帶分析。 結(jié)果： 1.Real-time PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足底電擊組大鼠海馬內(nèi)IRP1 mRNA水平升高57.0％(P<0.05),IRP2 mRNA表達(dá)量無顯著變化。 2.Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足底電擊組大鼠海馬內(nèi)IRP1表達(dá)增加(P<0.05)。 第四部分：軀體應(yīng)激條件下大鼠海馬內(nèi)IRP1轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 目的：通過對(duì)大鼠IRP1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分

9、析,并檢測(cè)軀體應(yīng)激條件下大鼠海馬內(nèi)與IRP1基因有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子活性,初步探討軀體應(yīng)激條件下大鼠海馬內(nèi)IPR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 方法： 1.動(dòng)物模型:采用大鼠足底電擊模型(同前),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同前。 2.IRP1基因啟動(dòng)子區(qū)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析:通過PubMed檢索人、小鼠和大鼠的IRPI基因序列。選取-2000到+100bp序列為啟動(dòng)子區(qū),通過TESS(Transcription Element Search S

10、ystem)軟件(http://www.cbil.upenn.edu/tess/)和TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(http://www.gene-regulation.com/pub/databascs.html＃transfac)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析,并篩選出保守的結(jié)合位點(diǎn)序列。 3.轉(zhuǎn)錄因子活性芯片測(cè)定:對(duì)照組和應(yīng)激組各取兩只大鼠的海馬組織,嚴(yán)格按照芯片試劑盒說明書進(jìn)行主要轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定。簡而言之,首先用Pan

11、omics核蛋白抽提試劑盒按照說明書抽提海馬組織的核蛋白。經(jīng)蛋白定量后,取10ug核蛋白抽提物與10ul TranSignal探針混合物混合、孵育。利用Panomics離心柱分離、回收與生物素標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。將與轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的寡核苷酸探針洗脫后,在42℃下與TranSignal芯片膜孵育過夜。洗膜后與20μl HRP耦聯(lián)鏈親和素抗體孵育。去除過量溶液,將膜以X光膠片曝光。將膠片掃描為電子圖片后用ScanAlyze軟件進(jìn)

12、行分析。 4.EMSA實(shí)驗(yàn):通過EMSA實(shí)驗(yàn)對(duì)GR和STAT5轉(zhuǎn)錄因子活性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。用非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)核蛋白抽提物進(jìn)行電泳分離,然后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜上,以254nm紫外光源激發(fā)光交聯(lián),封閉、洗膜后,加入發(fā)光反應(yīng)液,以X光膠片曝光,用ImageJ軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果: 1.IRP1基因啟動(dòng)子區(qū)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析:通過TESS軟件和TRANSFAC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析后,選擇匹配分值較高的序列,發(fā)現(xiàn)GR、

13、STAT家族等保守序列。 2.轉(zhuǎn)錄因子活性芯片測(cè)定:結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因有GR、STAT5等32種,表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有GATA等124種。 3.EMSA實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)錄因子活性芯片測(cè)定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果進(jìn)行比較,在表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因中選擇可能與IRP1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并且與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GR和STAT5進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,GR和STAT5與相應(yīng)序列的結(jié)合活性增大。

14、 結(jié)論： 1.足底電擊、水浸束縛和截肢創(chuàng)傷三種軀體應(yīng)激均可使大鼠部分腦區(qū)(大腦前額皮層、海馬和紋狀體)內(nèi)鐵含量增高,而小腦和腦干內(nèi)鐵含量不變,各軀體應(yīng)激組間無差異,表明不同軀體應(yīng)激均可改變大鼠腦內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài),使大腦前額皮層、海馬和紋狀體內(nèi)鐵含量顯著增多； 2.軀體應(yīng)激(足底電擊應(yīng)激模型)使大鼠海馬內(nèi)鐵蛋白含量降低,TfR表達(dá)量增加,而Lf、DMT1(有和無IRE型)表達(dá)量不變,表明軀體應(yīng)激使大鼠腦內(nèi)鐵代謝主要相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生

15、變化,TfR表達(dá)增多而鐵蛋白表達(dá)減少,導(dǎo)致細(xì)胞鐵攝入增加,而鐵儲(chǔ)存能力下降,這可能是導(dǎo)致大鼠海馬等腦區(qū)內(nèi)鐵含量增多的原因之一； 3.軀體應(yīng)激使IRP1蛋白質(zhì)和mRNA水平均升高,而IRP2表達(dá)量無顯著變化,提示軀體應(yīng)激條件下大鼠海馬內(nèi)TfR表達(dá)增加、鐵蛋白表達(dá)減少可能與IRP1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控變化有關(guān)： 4.軀體應(yīng)激使大鼠海馬內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GR和STAT5的DNA結(jié)合活性增強(qiáng),提示GR和STAT5的激活可能是軀體應(yīng)激條件下大鼠海