胃內(nèi)的分泌蛋白影響骨質(zhì)代謝的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目前針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的藥物干預(yù)主要包括兩方面：骨吸收抑制劑和骨和成促進(jìn)劑。骨吸收抑制劑包括：雌激素、降鈣素、雙磷酸鹽等。這些藥物可以通過抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能減少骨量的損失，從而暫時(shí)防治骨質(zhì)疏松癥，但是由于骨的更新轉(zhuǎn)化受抑制將導(dǎo)致骨質(zhì)的老化、陳舊。因此治療骨質(zhì)疏松癥不僅需要應(yīng)用骨吸收抑制劑來防止骨量持續(xù)降低，而且還需同時(shí)使用刺激骨形成的藥物以增加骨量，可采用聯(lián)合用藥。骨吸收抑制劑只能維持骨量和暫時(shí)骨形成增加，應(yīng)用骨形成促進(jìn)劑才會(huì)有效地提

2、高骨量，這也是當(dāng)前世界治療骨質(zhì)疏松癥新藥研究的主要方向。目前，骨形成刺激劑主要為甲狀旁腺激素，已于2002年由美國FDA批準(zhǔn)用于骨質(zhì)疏松癥治療。但已有的PTH制劑價(jià)格昂貴，需注射給藥，限制了其推廣應(yīng)用；而且有研究認(rèn)為PTH的正性作用僅限于脊柱，其他部位可能均為負(fù)性效應(yīng)，對(duì)骨折風(fēng)險(xiǎn)的影響尚待進(jìn)一步研究。 總之，針對(duì)與胃粘膜中存在的這種促進(jìn)骨合成活性物質(zhì)的研究及應(yīng)用有著廣闊的研究、開發(fā)前景。然而到目前為止，這種從功能表現(xiàn)方面推測(cè)出的

3、胃鈣素到底是什么蛋白，仍舊未知。其性質(zhì)不明則難以針對(duì)其進(jìn)一步研究，難以闡明胃切除或病變誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，也就無從采取基于此方面的各種具有針對(duì)性的干預(yù)措施。因此本課題為試圖闡明胃鈣素的性質(zhì)，展開了一系列探索性研究。 研究目的： 1.觀察胃粘膜提取物對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的作用。因?yàn)槌晒羌?xì)胞是機(jī)體骨質(zhì)形成的執(zhí)行者，以往的研究雖然已確定了胃粘膜提取物中含有促進(jìn)機(jī)體骨量增加的因子，但是其對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響尚無研究，

4、所以我們首先要明確胃粘膜提取物是否對(duì)成骨細(xì)胞的成骨活性有影響，有何影響。 2.對(duì)胃鈣素候選蛋白進(jìn)行篩選，從而確定胃鈣素的性質(zhì)。根據(jù)胃粘膜中促進(jìn)骨形成因子可受胃泌素調(diào)控，即胃泌素可以促進(jìn)這種因子釋放的特點(diǎn)，本文采用了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)受胃泌素干預(yù)前后，胃粘膜中所差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行篩選，試圖從這些差異表達(dá)的蛋白中找到這種促進(jìn)骨形成因子——即胃鈣素。 研究意義： 1.觀察胃粘膜提取物對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的作用將闡明其促

5、進(jìn)成骨的作用機(jī)制。 2.篩選出胃鈣素并確定其性質(zhì)，將有利于闡明胃切除或病變誘發(fā)骨代謝疾病的機(jī)制，有助于加深對(duì)骨代謝和OP的病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)；為防治OP提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。 擬解決的科學(xué)問題: 1.胃泌酸粘膜提取物是否直接通過成骨細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)成骨的作用？ 2.胃泌素干預(yù)后胃粘膜組織中所表達(dá)的差異蛋白有哪些？ 3.胃泌酸粘膜提取物中這種促進(jìn)骨合成因子——即胃鈣素究竟是什么？ 研究方法：

6、1.采用多次酶消化法，體外分離培養(yǎng)大鼠幼鼠的成骨細(xì)胞，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、Giemsa染色、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)染色、熒光染色等方法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2.大鼠胃粘膜組織蛋白的制備。取大鼠胃囊，剝離下胃粘膜組織置于勻漿緩沖液中進(jìn)行勻漿。離心、棄沉淀，上清液通過一系列空隙從大到小的微孔濾膜進(jìn)行過濾。濾液離心、棄上清，沉淀溶于鹽水中，超聲冰上震蕩，濾菌、測(cè)濃度后以生理鹽水將其稀釋為低（10-3g/l）、中（10-2g/l）、高（

7、10-1g/l）三種濃度，-80℃保存。 3.激光共聚焦顯微鏡觀察。成骨細(xì)胞接種于激光共聚焦顯微鏡專用皿中，細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后行細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光標(biāo)記。將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，觀察施加不同濃度胃粘膜提取物刺激前后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，獲得反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的曲線。 4.成骨細(xì)胞的增殖觀察。細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種2000個(gè)細(xì)胞，過夜細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度的胃粘膜提取物

8、或以生理鹽水作為對(duì)照來干預(yù)細(xì)胞，按照CCK-8試劑盒的方法，采用紫外分光光度儀分別檢測(cè)加入刺激因素前，刺激后1天、2天、3天的光密度值。 5.RT-PCR實(shí)驗(yàn)。成骨細(xì)胞接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，貼壁、融合更換培養(yǎng)液，以不同濃度的胃粘膜提取物或生理鹽水對(duì)照來干預(yù)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。TrizolReagent提取細(xì)胞總RNA后測(cè)濃度，定量后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出collagen type Ⅰ，osteo

9、calcin和β-actin目的基因。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液，瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)做PCR產(chǎn)物半定量分析。 6.Western-blot檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)不同濃度胃粘膜提取物干預(yù)后分別提取細(xì)胞的總蛋白、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉一抗雜交、洗膜、二抗雜交、再洗膜，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，顯影，定影。檢測(cè)collagen type Ⅰ，osteocalcin和β-actin蛋白的印跡圖像并用光密度掃描儀半定量分析

10、。 7.蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)。提取胃泌素干預(yù)前、后的胃粘膜組織的總蛋白，經(jīng)除鹽、定量等處理后，采用熒光差異雙向電泳技術(shù)（2D-DIGE）分離，經(jīng)質(zhì)譜技術(shù)（MS）分析鑒定出經(jīng)胃泌素干預(yù)的胃粘膜組織所差異表達(dá)的蛋白。 8.生物信息學(xué)技術(shù)分析：利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，文獻(xiàn)分析對(duì)所鑒定的差異蛋白進(jìn)行分析，從中找到感興趣的候選蛋，以進(jìn)一步確定下一步的研究方向。 9.利用Western-blot技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)所篩選出

11、的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 10.利用免疫組化技術(shù)對(duì)所篩選出的蛋白在胃粘膜中的定位及分布情況進(jìn)行觀察。 結(jié)果： 1.形態(tài)學(xué)觀察，堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色和細(xì)胞結(jié)節(jié)染色表明：培養(yǎng)的細(xì)胞符合成骨細(xì)胞的形態(tài)特征，具有分泌堿性磷酸酶和形成礦化結(jié)節(jié)的生物學(xué)行為。 2.激光共聚焦顯微鏡觀察胃粘膜提取物刺激前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化：在每個(gè)視野中分為4個(gè)象限，在每個(gè)象限中隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞，共20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果為：對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)

12、的鈣離子濃度無任何變化，低濃度實(shí)驗(yàn)組有15%的細(xì)胞（20個(gè)細(xì)胞中有3個(gè)），中濃度組有35%（20個(gè)細(xì)胞中有7個(gè)），高濃度組有95%（20個(gè)細(xì)胞中有19個(gè)）發(fā)生了鈣離子濃度短暫、快速增高的變化。 3.成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：不同濃度的胃粘膜提取物干預(yù)后第一、二、三天的細(xì)胞數(shù)量均比對(duì)照組增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較存在差異，而且差異具有顯著性（p<0.01）。 4.RT-PCR與western-blot實(shí)驗(yàn)：與對(duì)

13、照組比較，三組不同濃度的實(shí)驗(yàn)組，均可提高collagen type Ⅰ和osteocalcin的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異存在顯著性（p<0.05）。 5.蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)：經(jīng)胃泌素干預(yù)后，胃粘膜組織中差異表達(dá)蛋白50個(gè)，其中增高表達(dá)21個(gè)，降低表達(dá)29個(gè)。經(jīng)質(zhì)譜分析后鑒定出了22個(gè)差異蛋白。 6.生物信息學(xué)分析：對(duì)上述22個(gè)差異蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，蛋白質(zhì)之間相互作用預(yù)測(cè)，以及利用已有的文獻(xiàn)對(duì)其功能、作

14、用進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶A3（Protein disulfide-isomerase A3，PDIA3）經(jīng)胃泌素干預(yù)后，在胃粘膜中高度表達(dá)；而且其在無機(jī)鹽代謝過程中起著重要作用：其作為維生素D3在靶細(xì)胞膜上的受體蛋白，存在于腸粘膜細(xì)胞，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成釉等細(xì)胞的膜上。PDIA3與維生素D3結(jié)合后可以快速促進(jìn)鈣磷在腸道內(nèi)的吸收；誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞一系列的生化反應(yīng)，包括：細(xì)胞膜通透性的改變，鈣離子內(nèi)流，磷脂的翻轉(zhuǎn)，還有蛋

15、白激酶C的激活，還具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)礦化的作用。另外，其不僅存在于細(xì)胞膜上，也在細(xì)胞外質(zhì)中有表達(dá)。 7.經(jīng)Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃泌素干預(yù)后的大鼠胃粘膜中的PDIA3/1，25D3-MARRS蛋白表達(dá)量增加，這一結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，從而從逆向?qū)嶒?yàn)角度對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。 8.免疫組化對(duì)PDIA3/1，25D3-MARRS在胃粘膜中的定位及分布情況進(jìn)行觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：在大鼠和

16、人的胃粘膜下層中的胃腺管內(nèi)遍布PDIA3/1，25D3-MARR蛋白的陽性表達(dá)。 結(jié)論： 1.胃粘膜提取物可呈劑量依賴關(guān)系引起成骨細(xì)胞內(nèi)的鈣離子迅速短暫地增加。 2.胃粘膜提取物能夠地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。 3.胃粘膜提取物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性。 4.PDIA3/1，25D3-MARRS被認(rèn)為是胃粘膜組織中促進(jìn)骨合成作用的關(guān)鍵因素。 5.PDIA3/1，25D3-MARRS是可由胃粘膜內(nèi)

17、分泌的分泌蛋白。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.以往的研究發(fā)現(xiàn)胃粘膜提取物具有促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨量的作用，通過本研究項(xiàng)目不但驗(yàn)證了這一論點(diǎn)，而且闡明其成骨作用是通過直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化來完成的。 2.利用胃泌素干預(yù)后胃鈣素表達(dá)增加的特點(diǎn)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，包括：2D-DIGE，基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)胃鈣素的候選蛋白進(jìn)行篩選。 3.提出PDIA3可能就是胃組織內(nèi)促進(jìn)骨合成的活性因子。目前，所謂的