二苯乙烯苷防治骨質(zhì)疏松的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是全身性、退行性、代謝性骨骼疾病,是由多種病因?qū)е鹿墙M織骨量丟失、結(jié)構(gòu)改變和生物力學(xué)性能減退,容易發(fā)生骨折,嚴(yán)重威脅老年人的身心健康。氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體內(nèi)活性氧自由基 ROS(Reactive oxygen species)產(chǎn)生過多,超出了機(jī)體的清除能力,導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。高濃度的ROS可以導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng),損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,

2、引起疾病的發(fā)生。許多衰老性疾病與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。目前,大量研究已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激在OP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過量的ROS的產(chǎn)生可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和降低其分化能力,促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和活化,影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的偶聯(lián),進(jìn)而降低骨形成,促進(jìn)骨吸收,使骨量減少。骨質(zhì)疏松病人血漿氧化應(yīng)激水平升高同骨密度降低具有相關(guān)性。因此,利用抗氧化劑來防治OP成為研究熱點(diǎn)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)許多營養(yǎng)物質(zhì)及中藥具有抗氧化作用,進(jìn)而發(fā)揮骨保護(hù)作用。二苯乙烯苷

3、(TSG)是從傳統(tǒng)中藥何首烏中提取的有效成分之一,具有抗氧化功效。那么,TSG能否應(yīng)用于治療OP呢?目前還未見相關(guān)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分,擬通過在體外研究 TSG對氧化應(yīng)激造成的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1凋亡和成骨分化抑制的逆轉(zhuǎn)作用及在體內(nèi)研究小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型中,TSG能否提高骨密度,改善骨組織微結(jié)構(gòu),進(jìn)而改善OP,并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。本研究可以提供TSG治療OP的新用途,為尋找治療OP的中藥提供理論依據(jù)。<

4、br>　　1 TSG對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1凋亡的預(yù)防作用及機(jī)制研究
　　目的研究TSG對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1凋亡的預(yù)防作用,并初步探討相關(guān)機(jī)制。方法建立體外氧化應(yīng)激模型,100、200、300和400μM/L的H2O2分別作用2h、6h、12h和24h,MTT法評價(jià)細(xì)胞存活情況,篩選合適H2O2作用濃度;觀察不同濃度0.01、0.1、1、10、50μM/L TSG對成骨前體細(xì)胞MC3T3

5、-E1增殖作用的影響,評價(jià)藥物的毒性作用;篩選的合適濃度的TSG和 H2O2共同作用,實(shí)驗(yàn)分組:①空白對照組;②單純H2O2處理組;③H2O2+TSG0.1μM處理組;④H2O2+TSG1μM處理組;⑤H2O2+TSG10μM處理組;⑥陽性對照抗氧化劑NAC1mM處理組。通過MTT法、顯微鏡下大體觀察、Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀來評價(jià)細(xì)胞凋亡情況及TSG對氧化損傷的保護(hù)作用;利用熒光酶標(biāo)儀和MDA檢測試劑盒來檢測細(xì)胞中RO

6、S及MDA的水平來評價(jià)細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài);Western-blot和RT-PCR分別從蛋白水平和基因水平評價(jià)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平,初步闡述TSG對氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果篩選出合適H2O2作用濃度為300μM/L,作用24h,用于后續(xù)研究;TSG在觀察濃度內(nèi)對MC3T3-E1無毒性作用(P>0.05);與空白對照組相比,單純H2O2處理可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡,顯微鏡下大體觀察可見許多細(xì)胞已死亡,脫壁;Hoechst3325

7、8染色可見有較多的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核濃集現(xiàn)象;不同濃度的TSG預(yù)處理后,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到改善;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示:空白組、H2O2處理組、不同濃度TSG預(yù)處理組及NAC處理組的細(xì)胞凋亡率分別為5.8％、30.1%、22.1%、15.3%、14.3%、9.2%?？梢?單獨(dú)H2O2作用可以導(dǎo)致成骨前體細(xì)胞出現(xiàn)較大程度的凋亡,不同濃度TSG預(yù)處理后,細(xì)胞凋亡率有所降低(P<0.05);單純H2O2作用可以導(dǎo)致細(xì)胞水平的ROS和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物

8、 MDA產(chǎn)生增加,TSG(1-10μM)可以顯著降低細(xì)胞水平 ROS和 MDA水平(P<0.05),改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài);Western-blotting和實(shí)時(shí)定量 RT-PCR結(jié)果提示:TSG預(yù)處理可以減少H2O2處理后促凋亡蛋白Bax的表達(dá),增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1凋亡增加,TSG可以通過降低氧化應(yīng)激水平及改善線粒體凋亡Bcl-2/Bax信號通路來起到保護(hù)作用。
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9、 TSG對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化能力降低的預(yù)防作用及機(jī)制研究
　　目的探討TSG對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化能力降低的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制研究,為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。方法將成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1均勻接種到六孔板內(nèi),待細(xì)胞達(dá)80%鋪滿時(shí),給予成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組:①空白對照組;②單純H2O2處理組;③H2O2+TSG0.1μM處理組;④H2O2+TSG1μM處理組;⑤

10、H2O2+TSG10μM處理組;⑥NAC1mM處理組。誘導(dǎo)6、14或21天后,依組分別給予不同濃度TSG預(yù)處理24h,然后給予H2O2處理24h。通過ALP染色及ALP定量分析來評價(jià)成骨分化的標(biāo)志物ALP的表達(dá)如何;通過茜素紅染色來評價(jià)成骨細(xì)胞的礦化程度;通過實(shí)時(shí)定量 RT-PCR來檢測成骨分化相關(guān)基因 ALP、COL-1和OCN的表達(dá)情況。為了進(jìn)一步闡明相關(guān)的作用機(jī)制,我們利用熒光酶標(biāo)儀檢測成骨細(xì)胞內(nèi)ROS的水平及MDA試劑盒檢測脂質(zhì)

11、氧化水平來反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,并利用ELISA試劑盒檢測骨吸收相關(guān)因子RANKL和IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果同空白對照組相比,單純 H2O2處理可以明顯降低成骨分化標(biāo)記物 ALP染色和定量結(jié)果;減少細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積量;下調(diào)成骨分化相關(guān)基因ALP、COL-1和OCN的表達(dá)水平(P<0.05)。當(dāng) TSG預(yù)處理24h后,TSG(0.1-10μM)以劑量依賴方式明顯改善ALP活性(P<0.05);改善ALP染色和鈣結(jié)節(jié)沉積;顯著提高成骨分

12、化基因ALP、COL-1和OCN的表達(dá)水平(P<0.05)。單純H2O2處理,細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平顯著提高,而TSG(1-10μM)預(yù)處理可以明顯降低ROS及MDA水平(P<0.05)。ELISA檢測也得出相同的結(jié)果,TSG(0.1-10μM)及(10μM)分別降低 H2O2作用導(dǎo)致的RANKL和 IL-6的升高(P<0.05)。結(jié)論氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化能力抑制,TSG可能部分通過降低氧化應(yīng)激水平及骨

13、吸收因子的表達(dá),在一定程度上逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。
　　3 TSG對小鼠去勢骨質(zhì)疏松模型的預(yù)防作用
　　目的研究 TSG對小鼠去勢骨質(zhì)疏松模型中骨密度、骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)改變的預(yù)防作用。方法32只9月齡BALB/c雌性小鼠,平均體重為19.73±2.011g,隨機(jī)分為四組:①假手術(shù)組(SHAM);②單純卵巢去勢組(OVX);③卵巢去勢并小劑量TSG處理組(OVX+TSG5mg/kg);④卵巢去勢并高劑量TSG處理組(OVX+TS

14、G20mg/kg)。戊巴比妥鈉(50 mg/kg i.p.)麻醉成功后,通過背側(cè)入路移除雙側(cè)卵巢,術(shù)后7天,依分組情況每天給予腹腔注射藥物或雙蒸水,持續(xù)3個(gè)月。心臟采血,離心后,取血清用于檢測MDA和GSH表達(dá)水平,來評價(jià)血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)。取第4腰椎及左側(cè)股骨,剔除周圍軟組織,4%多聚甲醛固定后,用于顯微 CT(Micro-CT)、HE染色、VG染色和Von kossa染色來評價(jià)TSG對骨密度、骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)的作用程度。結(jié)果與S

15、HAM組相比,OVX組血清中MDA水平升高、GSH水平降低(P<0.05)。OVX+TSG20mg/kg可以明顯改善血清中 MDA水平(P<0.05),但對于GSH水平的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。不同劑量TSG處理組之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Micro-CT結(jié)果提示:與SHAM組相比,OVX組的第四腰椎及股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨量減少,BV/TV、Conn.D、Tb.N、Tb.Th及 BMD值減少(P<0.01),SMI和Tb

16、.Sp增加(P<0.05)。OVX+TSG20mg/kg可以明顯改善去卵巢導(dǎo)致的這些骨組織微結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變(P<0.05)。OVX+TSG5mg/kg可以改善骨組織微結(jié)構(gòu)參數(shù)值,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。不同劑量TSG處理組之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。脫鈣骨組織石蠟切片HE染色及不脫鈣骨組織塑料包埋切片VG和Von kossa染色結(jié)果均提示:OVX組與SHAM組相比,骨小梁數(shù)量減少,間距增大,而經(jīng)不同濃度 TSG處理后