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文檔簡介
1、研究背景 保持能量代謝平衡對(duì)維持心臟功能具有重要意義。最近有人提出代謝重構(gòu)的概念,即由于心肌細(xì)胞糖類和脂肪等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能異常的現(xiàn)象。慢性心力衰竭(CHF)往往與代謝重構(gòu)相伴隨,兩者之間存在密切關(guān)系。研究心肌能量代謝,特別是代謝重構(gòu)在CHF發(fā)生發(fā)展中的作用,具有十分重要的意義。 CHF時(shí)血漿兒茶酚胺類物質(zhì)濃度增高,除了對(duì)心肌組織有直接毒性作用,尚能增加β腎上腺素能受體介導(dǎo)的脂解作用,
2、使能量消耗增加,脂肪儲(chǔ)存減少。研究證實(shí),心肌肥厚和CHF時(shí)能量代謝底物利用顯著變化是從優(yōu)先利用脂肪酸(FA)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖,同時(shí)調(diào)節(jié)脂肪酸氧化(FAO)的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α及其目的基因表達(dá)和活性下降。FA來源增加,去路受阻導(dǎo)致FA堆積,不但對(duì)心肌細(xì)胞具有直接脂毒性作用,還能抑制糖代謝過程,使ATP產(chǎn)生減少,心肌能量代謝障礙。因此,抑制交感神經(jīng)過度激活,逆轉(zhuǎn)心肌代謝底物轉(zhuǎn)換,是改善代謝重構(gòu)、治療CHF的理論基礎(chǔ)
3、。 衰竭心臟β3受體表達(dá)上調(diào),介導(dǎo)的負(fù)性肌力作用增強(qiáng),導(dǎo)致CHF晚期心臟功能進(jìn)一步抑制。β3受體在兒茶酚胺作用下能增加脂肪分解,影響心臟代謝。最近發(fā)現(xiàn),β3受體能磷酸化激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)1/2-絲裂素活化蛋白激酶(MAPK),后者能磷酸化PPARα,使其表達(dá)減少或活性下降,繼之引起FAO受損,出現(xiàn)代謝重構(gòu)。本課題從臨床病人、動(dòng)物模型和心肌細(xì)胞培養(yǎng)三個(gè)層面進(jìn)行研究,并給予相應(yīng)的藥物干預(yù),探討CHF時(shí)β阻滯劑對(duì)能量代謝
4、變化的影響和β3受體、PPARα變化在代謝重構(gòu)中的作用及意義。 研究方法 1.選取CHF病人,隨機(jī)給予美托洛爾和卡維地洛治療6個(gè)月,對(duì)比治療前后外周血細(xì)胞因子和游離脂肪酸(FFA)含量;比較健康人和CHF病人血中FFA濃度差異。 2.對(duì)比健康人和CHF病人心肌組織FFA、乳酸(LD)含量及琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性;免疫組化檢測(cè)心肌組織β3受體、PPARα和維甲酸
5、X受體α(RXRα)的表達(dá)及定位;RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)心肌組織β3受體和PPARα的mRNA和蛋白表達(dá)。 3.建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型,分為心梗對(duì)照組、卡維地洛組;非諾貝特組和聯(lián)合用藥組(同時(shí)給予卡維地洛和非諾貝特),并設(shè)假手術(shù)組。8周后檢測(cè):(1)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):心率、左心室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和左室壓力最大下降速率(-dp/dtmin);(2)心肌組織F
6、FA、LD、SDH及ATP酶含量;(3)免疫組化檢測(cè)心肌組織β3受體和PPARα表達(dá)變化及定位;(4)RT-PCR檢測(cè)心肌組織β3受體、PPARα、RXRα、MCAD、M-CPT-1和Erk2的mRNA表達(dá)。(5)WesternBlot檢測(cè)心肌組織β3受體和PPARα蛋白表達(dá)變化。 4.培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,分為空白組,BRL37344組,BRL37344+PD98059組和SR59230組,RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)
7、PPARα基因和蛋白及Erk1/2蛋白表達(dá)。 5.以5×10-4mol/L濃度FFA刺激心肌細(xì)胞24h后,分為BRL組,SR組和CF組,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。48h后觀察細(xì)胞形態(tài)和搏動(dòng)頻率;MTT檢測(cè)細(xì)胞活性;RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞β3受體、PPARα、MCAD和M-CPT-1的mRNA表達(dá);WesternBlot檢測(cè)心肌細(xì)胞β3受體和PPARα蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1.CHF病人外周血FFA濃度較健康人增加,β阻滯劑
8、治療后細(xì)胞因子和FFA濃度明顯降低,卡維地洛組低于美托洛爾組; 2.與正常心肌比較,衰竭心肌FFA和LD含量明顯增加,SDH、Na+K+-ATP和Ca2+Mg2+-ATP活性下降。β3受體mRNA和蛋白表達(dá)增加,PPARα則與之相反。 3.卡維地洛組和聯(lián)合用藥組大鼠心率、LVEDP明顯低于心梗對(duì)照組和非諾貝特組;+dp/dtmax和-dp/dtmin絕對(duì)值則相反,其余各組間無明顯差異。 4.三個(gè)治療組心肌組織FF
9、A和LD水平顯著低于心梗對(duì)照組,非諾貝特組和聯(lián)合用藥組又低于卡維地洛組;聯(lián)合用藥組SDH活性增加,單獨(dú)用藥無此作用;非諾貝特組和聯(lián)合用藥組Na+-K+ATP和Ca2+-Mg2+ATP活性明顯增加。 5.與假手術(shù)組比較,CHF大鼠心肌β1受體、PPARα、RXRα、MCAD和M-CPT-1mRNA表達(dá)明顯降低,β2受體mRNA表達(dá)無明顯變化,β3受體和ErkmRNA表達(dá)增加。與心梗對(duì)照組比較,所有治療大鼠β1和β2受體無明顯變化,
10、β3受體和ErkmRNA表達(dá)顯著降低,PPARα和RXRαmRNA表達(dá)則增加。MCAD和M-CPT-1mRNA在聯(lián)合用藥組和非諾貝特組相對(duì)于對(duì)照組和卡維地洛組表達(dá)增加。 6.與假手術(shù)組比較,CHF大鼠心肌組織β3受體蛋白表達(dá)增加,PPARα表達(dá)減少??ňS地洛組和聯(lián)合用藥組相對(duì)于對(duì)照組和非諾貝特組β3受體蛋白表達(dá)顯著降低。治療組PPARα蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,但組間沒有顯著性差異。 7.藥物刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞48h后,BR
11、L組PPARα蛋白表達(dá)顯著降低,BRL+PD組和SR組較BRL組增加,但仍低于對(duì)照組。四組心肌細(xì)胞織總Erk水平?jīng)]有顯著差異,磷酸化的Erk在對(duì)照組和SR組表達(dá)很少,BRL組明顯增多,同時(shí)給予PD后則完全不表達(dá)。 8.相對(duì)于正常心肌細(xì)胞,F(xiàn)FA組細(xì)胞存活率降低,MTT吸光度減小,細(xì)胞表面積變小,呈萎縮狀態(tài)但搏動(dòng)頻率無變化。在FFA刺激的心肌細(xì)胞,F(xiàn)FA+BRL組、FFA+SR組和FFA+CF組較FFA組MTT吸光度顯著降低,三組
12、細(xì)胞存活率較FFA組進(jìn)一步下降,而正常心肌細(xì)胞各組存活率沒有差別,Comtrol+BRL組MTT吸光度下降,Control+SR組和Control+CF組細(xì)胞MTT吸光度增加。無論是FFA刺激細(xì)胞還是正常細(xì)胞,搏動(dòng)頻率在BRL組降低,SR組升高,而CF組無變化。 9.FFA組細(xì)胞β3受體、PPARα和M-CPT-1mRNA表達(dá)均較Control組增加。在正常細(xì)胞,Control+BRL組β3受體mRNA表達(dá)增加,Control+
13、SR組則減少,Control+CF組無變化。在FFA刺激細(xì)胞,F(xiàn)FA+BRL組和FFA+CF組β3受體mRNA上調(diào),F(xiàn)FA+SR組則相反。PPARα和M-CPT-1mRNA在正常細(xì)胞各組間無明顯差異;而在FFA刺激細(xì)胞,F(xiàn)FA+CF上調(diào)二者mRNA水平。 10.FFA組細(xì)胞β3受體、PPARα蛋白表達(dá)均較正常組增加。在正常細(xì)胞,Control+BRL組β3受體蛋白表達(dá)增加,Control+SR組則減少,control+CF組無變
14、化。在FFA刺激細(xì)胞,F(xiàn)FA+BRL組和FFA+CF組β3受體蛋白表達(dá)增加,F(xiàn)FA+SR組則相反。PPARα蛋白在正常細(xì)胞各組間無明顯差異,而在FFA+BRL組下調(diào),F(xiàn)FA+SR組和FFA+CF組則表達(dá)增加。 結(jié)論 1.人類和大鼠衰竭心肌均發(fā)生代謝重構(gòu),β阻滯劑能夠部分逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;非選擇性β阻滯劑卡維地洛作用優(yōu)于選擇性β阻滯劑美托洛爾。 2.卡維地洛能改善CHF大鼠心臟功能,逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu);非諾貝特不具有這一效應(yīng)
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