鐵過載對巨噬細(xì)胞及MDS紅系造血的影響及機制研究.pdf

1、目的：研究鐵過載對巨噬細(xì)胞及骨髓增生異常綜合征(MDS)紅系造血的影響及其作用機制。
　　方法：①在培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的過程中分別添加不同濃度（5、10、20、40、80μmol/L)枸櫞酸鐵銨(FAC)建立鐵過載巨噬細(xì)胞模型（鐵過載組），以不添加FAC作為對照組，應(yīng)用可變鐵池（LIP）檢測證實細(xì)胞鐵過載。檢驗這一過程中細(xì)胞數(shù)量及狀態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞吞噬功能的變化，細(xì)胞生成活性氧（ROS）、活性氮（NOS）水平以及與之相關(guān)的氧化應(yīng)激信號

2、通路的變化。再用地拉羅司（DFX）去鐵及抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸( NAC)清除過多的ROS后，檢測上述指標(biāo)的變化。②通過給予MDS小鼠的同窩野生型小鼠及MDS雄性小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵的方法建立小鼠慢性鐵過載模型，實驗分為4組，分別為對照組（Ctrl），鐵過載組(IO)，MDS組(MDS)及MDS+鐵過載組(MDS+IO)。通過普魯士藍(lán)染色、肝脾指數(shù)、骨髓細(xì)胞LIP水平檢測驗證小鼠鐵過載模型的建立，通過單側(cè)骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC）

3、計數(shù)、骨髓造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)、骨髓紅細(xì)胞不同分期比例檢測證實鐵過載對紅系造血的損傷，通過檢測紅細(xì)胞ROS水平、NOX4及GPX1的mRNA表達(dá)水平、TGF-β家族成員的m RNA表達(dá)水平、血清轉(zhuǎn)化生長因子11（GDF11）濃度，研究MDS鐵過載損傷紅系造血的機制。
　　結(jié)果：⑴在培養(yǎng)液中加入不同濃度FAC培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)LIP水平升高，且具有濃度依賴性，在含80μmol/L FAC的培養(yǎng)液中LIP水平達(dá)到最高。⑵隨著FAC濃度

4、的提高，巨噬細(xì)胞的活性逐漸降低，依次為對照組的51.58％、40.98%、16.23%、3.46%、0.05%(均P＜0.05)。選取活性降低至16.23%的FAC濃度(20μmol/L)作為后續(xù)實驗鐵過載組。⑶和對照組相比，鐵過載組巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少至對照組的32.80%（P<0.05），細(xì)胞狀態(tài)由貼壁變?yōu)椴糠謶腋。昏F過載組巨噬細(xì)胞的吞噬功能降低至對照組的20.40%（P<0.05）。⑷進(jìn)一步的機制研究發(fā)現(xiàn)鐵過載組的活性氧水平及活性氮

5、水平分別是對照組的7.71及1.45倍（均P<0.05）；經(jīng)過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，參與活性氧生成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）基因、參與活性氮生成的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因的mRNA表達(dá)水平升高，參與活性氧清除的基因谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）mRNA表達(dá)水平降低；氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）基因mRNA表達(dá)水平升高；負(fù)反饋調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的叉頭蛋白氧3（FOXO3）

6、基因mRN A表達(dá)水平降低。⑸鐵過載實驗組進(jìn)行去鐵及抗氧化治療后，上述損傷得到部分逆轉(zhuǎn)。⑹成功建立鐵過載小鼠模型：骨髓普魯士藍(lán)染色、骨髓細(xì)胞LIP水平檢測證實鐵過載模型建立。IO及MDS+IO組的肝脾指數(shù)相對對照組顯著升高，進(jìn)一步提示鐵沉積。⑺BMMNC計數(shù)變化：和Ctrl組（（30.06±1.76）*106）相比，IO組（（29.40±1.74）*106）及MDS組（（2.95±2.25）*106）右側(cè)股骨BMMNC計數(shù)降低，但差異無

7、統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），MDS+IO組（（19.12±5.18）*106）B MMNC計數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與IO組及MDS組相比， MDS+IO組BMMNC計數(shù)明顯降低（P<0.05）。⑻行集落分析發(fā)現(xiàn)：小鼠骨髓行集落培養(yǎng)結(jié)果顯示，和Ctrl組相比，IO組、MDS組、MDS+IO組紅細(xì)胞集落生成單位（CFU-E）、紅細(xì)胞爆式集落形成單位（BFU-E）計數(shù)都減低（P<0.05）；和IO組及MDS組相比，MDS+

8、IO組兩者計數(shù)也明顯減低（P<0.05）。⑼骨髓紅細(xì)胞不同分期比例變化:檢測晚期紅細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，和Ctrl組（5.64±0.83）相比，IO組（4.04±0.49）、MDS組（3.46±0.31）、MDS+IO組（1.80±0.59）組都降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；和IO組、MDS組相比， MDS+IO組的比例降低（P<0.05）。⑽晚期紅細(xì)胞中ROS水平升高：骨髓晚期紅細(xì)胞中，和Ctrl組（42994±3292）相比，IO

9、組（54757±5982）、MDS組（65778±8186）、MDS+IO組（107757±6690）組ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；和IO組及MD S組相比，MDS+IO組ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。⑾鐵過載引起ROS相關(guān)基因表達(dá)改變：采用RT-PCR技術(shù)檢測晚期紅細(xì)胞中NOX4及GPX1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，在IO、MDS、MDS+IO組中NOX4表達(dá)水平以及和IO組、

10、MDS組相比，MDS+I O組的NOX4表達(dá)水平得出和ROS水平相同的結(jié)論，而GPX1的表達(dá)水平與NOX4相反。⑿TGF-β家族成員的mRNA表達(dá)水平的變化：在晚期紅細(xì)胞中，和對照組相比，IO組、MDS組、MDS+IO組GDF11、GDF15、Activin B、Acvr2b、ALK5的表達(dá)水平升高；與IO組及MDS組相比， MDS+IO組中其基因表達(dá)水平也明顯升高。其中GDF11的表達(dá)水平改變最明顯。IO組、MDS組、MDS+IO組G

11、DF11的表達(dá)水平分別是對照組的3.56倍、3.89倍、5.24倍。⒀外周血清GDF11表達(dá)水平：和Ctrl組（（342.0±26.09）pg/ml）相比，IO組（（796.6±103.4）pg/ml）、MDS組（（678.0±78.14）pg/ml）、MDS+IO組（（1525.0±78.37）pg/ml）GDF11濃度升高（P<0.05）；和IO、MDS組相比， MDS+IO組GDF11濃度升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：鐵