PICK1基因敲除對(duì)炎性疼痛的作用及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：PICK1基因敲除對(duì)炎性痛覺(jué)行為學(xué)的影響
　　 目的：PICK1(蛋白激酶Cα相互作用蛋白1，protein interacting with Cαkinase 1)是從線蟲(chóng)到人的所有生物中非常保守的一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的膜結(jié)合蛋白，自1995年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已報(bào)道能與20多種蛋白發(fā)生相互作用。PICK1在人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)，廣泛分布于機(jī)體的各種組織。PICK1參與一些疾病的發(fā)

2、生，如：癌癥、精神分裂癥、疼痛、帕金森綜合癥等。雖然PICK1在這些疾病發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，但其廣泛的結(jié)合特性使其可能通過(guò)與疾病相關(guān)蛋白的相互作用進(jìn)而在疾病發(fā)生過(guò)程中扮演一定角色。
　　 炎癥是一種常見(jiàn)的病理情況，在組織炎癥時(shí)，病變部位可產(chǎn)生慢性持續(xù)性疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏，不僅使患者感到不適或痛苦，并且可造成諸多生理功能障礙和精神疾病，如睡眠失調(diào)、抑郁癥、注意力下降等。已有研究顯示PICK1基因敲除小鼠對(duì)機(jī)械性刺激反

3、應(yīng)減弱，但其對(duì)炎性疼痛的影響還不清楚。本實(shí)驗(yàn)的目的就是觀察PICK1基因敲除后小鼠炎性痛覺(jué)行為是否改變。
　　 方法：應(yīng)用PICK1基因敲除小鼠，皮下注射4%福爾馬林溶液造成炎性疼痛模型，與同窩野生型小鼠對(duì)比，觀察炎性痛覺(jué)行為的變化情況。
　　 結(jié)果：PICK1基因敲除后，其炎性痛覺(jué)行為學(xué)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為對(duì)炎性疼痛更加耐受。
　　 1. PICK1基因敲除對(duì)頭面部炎性痛覺(jué)行為學(xué)的影響。
　　 單側(cè)面部

4、觸須墊皮下注射4%福爾馬林溶液后，與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠每3 min時(shí)間內(nèi)用同側(cè)前肢或后肢摩擦注射部位的行為明顯減少。
　　 2. PICK1基因敲除對(duì)足部炎性痛覺(jué)行為學(xué)的影響。
　　 ⑴采用熱板法測(cè)小鼠基礎(chǔ)痛閾，發(fā)現(xiàn)與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠基礎(chǔ)痛閾值明顯增高。
　　 ⑵單側(cè)足背皮下注射4%福爾馬林溶液后，與同窩野生型小鼠比較，PICK1基因敲除小鼠痛閾值明顯增高。

5、>　　 結(jié)論：
　　 1. PICK1基因敲除小鼠對(duì)福爾馬林導(dǎo)致的面部炎性疼痛的兩期耐受性均增加，即不僅對(duì)第一相的急痛反應(yīng)耐受性增加，對(duì)炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的第二相中樞敏感化也有抑制作用。
　　 2. PICK1基因敲除小鼠單側(cè)足背皮下注射4%福爾馬林溶液前后對(duì)熱刺激引發(fā)的縮足反應(yīng)時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，提示PICK1基因敲除對(duì)生理性和炎性熱敏性疼痛耐受性均增強(qiáng)。
　　 第二部分：PICK1基因敲除對(duì)TG、DRG和脊髓背角A

6、SICs通道功能和表達(dá)的影響
　　 目的：酸敏感離子通道 (acid-sensing ion channels，ASICs)是ENaC/DEG (epithelial Na+channel/degenerin)通道超家族的成員之一，能被細(xì)胞外 pH下降或H+濃度上升直接激活。它廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，參與了很多重要的生理過(guò)程和病理反應(yīng)，與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性、腦缺血、疼痛等關(guān)系密切。H+激活A(yù)SICs可使神經(jīng)元去極

7、化，產(chǎn)生動(dòng)作電位，參與了組織酸化如缺血、炎癥、腫瘤、癲癇等時(shí)痛覺(jué)的感受。由中度pH降低所誘發(fā)的皮膚表面酸誘導(dǎo)疼痛主要是由ASICs介導(dǎo)的，而更強(qiáng)的酸化引起的疼痛則是ASICs和TRPV1共同參與。目前已克隆出的ASICs主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。PICK1通過(guò)其PDZ結(jié)構(gòu)域與ASIC1和ASIC2相互作用，對(duì)ASICs功能的發(fā)揮起到重要作用，但PICK1與外周和中樞感覺(jué)神經(jīng)元A

8、SICs之間具體作用如何以及有何意義？在上文中我們已經(jīng)證實(shí)PICK1基因敲除小鼠對(duì)炎性疼痛的耐受性增強(qiáng)，它的具體機(jī)制是什么？是否與ASICs有關(guān)？這些都值得我們?nèi)ミM(jìn)一步探討。
　　 方法：采用western blotting、全細(xì)胞膜片鉗、鈣影像技術(shù)和免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，觀察PICK1基因敲除前后，外周初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元和脊髓背角上ASICs的蛋白表達(dá)和功能的變化情況，探討可能的機(jī)制。
　　 結(jié)果：PICK1基因敲除后AI

9、SC1的功能和蛋白表達(dá)均降低而AISC3的功能和蛋白表達(dá)均無(wú)變化。
　　 1. PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上AISC1電流幅度減小，全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示野生型AISC1電流幅度為2.37±0.46nA，PICK1基因敲除后AISC1電流幅度減少為1.21±0.35 nA（n=7，p<0.05 vs wild type）。PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上通過(guò)ASIC1通道誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣升高減少。將細(xì)胞外液由pH 7.4迅速轉(zhuǎn)

10、換成pH 6.0時(shí)，野生型△[Ca2+]/[Ca2+]比值為0.218±0.034 (n=11 from 2 animals)，純合子為0.131±0.020 (n=10 from 2 animals，p<0.05 vs wild type)。將細(xì)胞外液由pH 7.4迅速轉(zhuǎn)換成pH 5.0時(shí)，野生型△[Ca2+]/[Ca2+]比值為0.818±0.204 (n=18 from 3 animals)，純合子為0.379±0.091 (n=

11、18 from 4 animals，p<0.01 vs wild type)。
　　 2. PICK1缺失造成的ASIC1功能損傷可能是由于ASIC1蛋白表達(dá)總量的減少所致，使其在細(xì)胞內(nèi)的分布均勻減少，但其亞細(xì)胞定位并無(wú)改變。Western blotting和免疫熒光的結(jié)果均顯示，小鼠TG、DRG和脊髓背角上ASIC1蛋白表達(dá)總量和熒光強(qiáng)度均減少，但分布并未改變，仍在細(xì)胞膜上和胞漿內(nèi)均勻分布(n=6)。
　　 3. PI

12、CK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上ASIC3和TRPV1的表達(dá)和功能無(wú)變化。膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上ASIC3和TRPV1電流幅值均無(wú)明顯變化（ASIC3：WT 2.59±0.41nA vs KO 2.43±0.39 nA，n=8，p＞0.05；TRPV1：WT 1314±268.3pA vs KO 1256±272.4pA，n=4，p＞0.05）；Western blotting和免疫熒光的結(jié)果均顯示，小鼠T

13、G、DRG上無(wú)論是ASIC3還是TRPV1的蛋白表達(dá)量都未發(fā)生改變；ASIC3和TRPV1在細(xì)胞膜上和胞漿內(nèi)均勻分布(n=6 for ASIC3 and n=3 for TRPV1)。
　　 結(jié)論：
　　 1. PICK1基因敲除造成ASICs的功能損傷。PICK1基因敲除小鼠TG神經(jīng)元上AISC1電流幅度減小，通過(guò)ASIC1通道誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣升高減少。根據(jù)不同ASIC亞單位的分布和特性，推測(cè)這一作用主要是通過(guò)ASIC1a

14、同聚體來(lái)實(shí)現(xiàn)，而與TRPV1和ASIC3無(wú)關(guān)。
　　 2. PICK1缺失造成的ASICs功能損傷可能是由于ASIC1蛋白表達(dá)總量的減少所致，使其在細(xì)胞內(nèi)的分布均勻減少，但其亞細(xì)胞定位并無(wú)改變。
　　 第三部分：PICK1對(duì)炎性痛時(shí)ASICs的作用及相關(guān)機(jī)制
　　 目的：炎性疼痛的產(chǎn)生一是由于一些致痛物質(zhì)的釋放，如緩激肽、前列腺素、P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等；另一方面，由于炎癥局部pH降低，可激活外周傷害感受器，

15、引起傷害性感受器神經(jīng)元產(chǎn)生失活速率較慢的長(zhǎng)時(shí)程去極化，促使痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生。在外周炎癥模型中，脊髓背角神經(jīng)元中ASIC1a蛋白表達(dá)明顯增加，抑制其表達(dá)可產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛效果。在神經(jīng)系統(tǒng)，PICK1通過(guò)其特有的PDZ區(qū)域與PKCα結(jié)合，一方面可以促進(jìn)PICK1的定位和作用發(fā)揮，另一方面，PICK1在PKC功能的發(fā)揮中也有重要作用。與PKC相同的是，PKA對(duì)ASICs功能的調(diào)節(jié)作用也需要PICK1來(lái)介導(dǎo)。
　　 我們通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)

16、，PICK1基因敲除小鼠對(duì)福爾馬林導(dǎo)致的面部炎性疼痛和足部炎性熱敏性疼痛耐受性均增加，但是其具體機(jī)制還不是很清楚。前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PICK1基因的缺失會(huì)影響生理情況下ASICs蛋白表達(dá)、細(xì)胞定位、電流幅度以及鈣的釋放，那么，在炎癥時(shí)PICK1對(duì)ASICs的作用是怎樣的？是否參與了PICK1對(duì)炎性痛覺(jué)行為學(xué)的作用？除了ASICs外一些炎性致痛物質(zhì)和PKA、PKC是否也參與了PICK1對(duì)炎性痛覺(jué)行為學(xué)的作用？這些也值得我們?nèi)ミM(jìn)一步探討。

17、r>　　 方法：采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，觀察PICK1基因敲除前后，ASICs、PKA、PKC、SP、CGRP的表達(dá)和分布情況，探討PICK1影響炎性痛覺(jué)行為學(xué)可能的機(jī)制。
　　 結(jié)論：
　　 1. 給予4%福爾馬林皮下注射后，小鼠TG、DRG和脊髓背角 ASIC1和ASIC3的表達(dá)均增加。不論是生理情況還是炎癥時(shí)，PICK1基因敲除可減少TG、DRG和脊髓背角ASIC1的表達(dá)和分布，但是PICK1缺失