ASIC1、PICK1在GERD動(dòng)物模型食管內(nèi)臟高敏感中作用的研究.pdf

1、研究目的：
　　胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease，GERD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素參與GERD的發(fā)生和發(fā)展，普遍認(rèn)為GERD的發(fā)生主要是由反流物對(duì)食管的化學(xué)性損傷、局部免疫炎癥反應(yīng)和食管內(nèi)臟高敏感等因素所致。大量研究證實(shí)GERD患者，尤其是NERD患者，食管對(duì)酸和機(jī)械性刺激的敏感性升高，提示食管內(nèi)臟高敏感對(duì)GERD癥狀的產(chǎn)生和持續(xù)具有重要作用。酸敏感離子通道(acid-sensing i

2、on channel，ASICs)是一種配體門控陽離子通道，當(dāng)細(xì)胞外pH下降和質(zhì)子濃度增加時(shí)被激活，產(chǎn)生內(nèi)向Na+電流，參與化學(xué)和機(jī)械信號(hào)的傳導(dǎo)。大量研究證實(shí)，ASICs與傷害性感受的產(chǎn)生和中樞致敏有關(guān)，參與疼痛的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生。蛋白激酶C結(jié)合蛋白1(protein interacting with C-kinase1，PICK1)是一種高度保守的外周膜蛋白，是唯一含有PDZ（PSD-95/Dlg/ZO-1）結(jié)構(gòu)域和BAR(Bin-Amph

3、iphysin-Rvs)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。其功能多樣，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸傳遞中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PICK1通過PDZ結(jié)構(gòu)域與ASIC1結(jié)合，調(diào)節(jié)ASIC1的表達(dá)和功能。GERD內(nèi)臟高敏感機(jī)制至今未明，ASIC1、PICK1是否參與GERD的發(fā)生和發(fā)展尚無明確報(bào)道。本研究意在明確GERD食管內(nèi)臟高敏感與軀體感覺的關(guān)系，ASIC1和PICK1是否參與食管酸敏感性的調(diào)節(jié)。
　　研究方法：
　　對(duì)雄性SD大鼠

4、分別采用不同材料和直徑的幽門限制術(shù)（A組:將特制18Fr Nelaton導(dǎo)管環(huán)套于幽門;B組:絲線結(jié)扎控制幽門直徑為4.17mm;C組:絲線結(jié)扎控制幽門直徑為3.42mm;D組:絲線結(jié)扎控制幽門直徑為2.98mm）結(jié)合胃底結(jié)扎術(shù)的方法建立GERD大鼠模型，S組為假手術(shù)組。術(shù)后觀察各組大鼠體重變化;取賁門5mm以上食管行食管大體觀察和蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色病理分析;對(duì)不同幽門直徑的幽門限制術(shù)后大

5、鼠的生存率及成模率進(jìn)行評(píng)估。雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)GERD組大鼠行幽門限制術(shù)結(jié)合胃底結(jié)扎術(shù)，控制幽門直徑為3.42mm，Sham組為假手術(shù)組，分別于術(shù)前1天，術(shù)后第3、7、11、15天檢測(cè)兩組大鼠機(jī)械縮足反射閾值(mechanical paw withdraw threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal paw withdraw latency，TWL);用DiI示蹤法定位食管特異性背根神經(jīng)節(jié)(dorsal r

6、oot ganglion，DRG)神經(jīng)元，術(shù)后第15天進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè);用Western Blot、RT-PCR的方法檢測(cè)術(shù)后第15天兩組大鼠食管黏膜及T3～T5DRG中ASIC1、PICK1蛋白表達(dá)和mRNA含量。用SPSS18.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，生存率和成模率用百分率表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析;不符合正態(tài)

7、分布的資料根據(jù)需要使用秩和檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;用Chi-square的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各組大鼠術(shù)后生存率和成模率進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.不同直徑幽門限制術(shù)建立GERD大鼠動(dòng)物模型的比較
　　術(shù)后S組大鼠毛發(fā)光澤，活動(dòng)敏捷。其余各組大鼠被毛粗糙、灰暗，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)遲緩，飲水量、食量下降。術(shù)后15天S組和B組大鼠體重增加，兩組大鼠體重?zé)o顯著性差異（296.00±19.40

8、8g vs278.50±19.156g，P=0.077），術(shù)后15天A、C、D組大鼠體重下降（168.75±13.823g，177.50±15.501g，152.00±5.701g），A、C、D組與Sham組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。S組生存率100％，A、B、C、D組生存率分別為40％、85％、60％、25％。5組生存率不全相等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001));其中S組與B組生存

9、率無顯著性差異（P=0.231）;S組生存率與A、C、D組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05);A組生存率與B組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;B組生存率與D組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　術(shù)后第15天取大鼠食管所見:S組食管黏膜光滑、完整，其余各組食管有不同程度黏膜糜爛、壞死、出血、潰瘍或瘢痕等。15天后食管HE病理示:S組食管上皮角質(zhì)層完整，上皮層薄。其余各組食管基底細(xì)胞增

10、生，乳頭延長(zhǎng)，超過上皮的2/3以上，潰瘍形成，黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。A、B、C、D組成模率分別為100％、41.18％、91.67％、100％。A組與B組相比，成模率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，A組與C組相比，C組與D組相比，成模率無顯著性差異(P=1.00)。B組與C組成模率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.GERD大鼠MWT下降，TWL無明顯改變，DRG神經(jīng)元敏感性升高
　　造模前1天GERD組與Sha

11、m組大鼠MWT無顯著性差異（49.14±15.44g vs54.63±8.80g，P=0.511）;造模后第3天兩組MWT明顯下降，兩組之間無顯著性差異（9.64±6.19g vs6.33±4.42g，P=0.307）;造模后第7、11、15天GERD組大鼠與Sham組相比縮足反射閾值明顯下降（7.98±5.66g vs24.28±17.02g，P＜0.05;12.08±13.78g vs36.12±16.60g,P＜0.01;16.1

12、6±17.71g vs39.40±14.97g,P＜0.05）。
　　造模前1天及造模后第3、7、11、15天，兩組大鼠TWL無顯著性差異（18.34±1.14s vs18.31±0.86s,P=0.948;9.10±0.91s vs8.43±0.80s,P=0.139;9.95±1.51s vs9.06±1.35s,P=0.232;13.26±1.61s vs11.70±1.84s，P=0.092;13.48±1.63s vs1

13、2.70±1.46s，P=0.335）。
　　膜片鉗結(jié)果顯示GERD組大鼠食管DRG神經(jīng)元靜息膜電位較Sham組去極化顯著（-45.27±0.56mV vs-51.91±0.34mV，P＜0.001）;GERD組大鼠DRG神經(jīng)元閾電流較S組明顯降低（25.91±5.98pA vs83.64±3.88pA，P＜0.001）;2倍、3倍閾電流刺激下GERD組、Sham組大鼠DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率明顯增加(6.27±0.76vs3

14、.36±0.41,P＜0.001)、(10.91±0.77vs5.64±0.49,P＜0.001)。
　　3.ASIC1在GERD組大鼠食管黏膜中表達(dá)下調(diào)，PICK1在GERD組大鼠食管黏膜中表達(dá)上調(diào)
　　Western Blot結(jié)果顯示GERD組大鼠食管黏膜ASIC1蛋白表達(dá)下降（1.1594±0.4678vs0.7190±0.2284，P＜0.05）;GERD組與Sham組大鼠DRG中ASIC1蛋白表達(dá)無顯著性差異（1.

15、4948±0.2657vs1.5180±0.6213，P=0.925）。與Sham組相比，GERD組大鼠食管黏膜PICK1蛋白表達(dá)上調(diào)(0.5109±0.2484vs0.9141±0.3924，P＜0.05)。GERD組與Sham組大鼠DRG中PICK1蛋白表達(dá)無顯著性差異(0.4963±0.4560vs0.3183±0.2476,P=0.375)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示GERD組大鼠食管黏膜ASIC1mRNA表達(dá)下降，差異有

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.0207±0.2126vs0.6559±0.1193，P＜0.01）;GERD組與Sham組大鼠DRG中ASIC1mRNA含量呈下降趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.9204±0.2190vs1.1055±0.2811，P=0.232）。與Sham組相比，GERD組大鼠食管黏膜PICK1mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.3428±0.1621vs1.0111±0.1626，P＜0.01），GERD組與Sham組DRG中P

17、ICK1mRNA含量無顯著性差異(1.0295±0.2249vs1.0176±0.1978,P=0.924)。
　　研究結(jié)論：
　　1.控制幽門直徑為3.42mm的幽門限制術(shù)結(jié)合胃底結(jié)扎術(shù)是建立GERD組大鼠模型的可靠方法;
　　2.GERD組大鼠食管特異性DRG神經(jīng)元興奮性增高，痛覺行為學(xué)顯示GERD組大鼠機(jī)械痛覺敏感性升高，提示內(nèi)臟高敏感影響軀體感覺的形成;
　　3.ASIC1在GERD組大鼠食管黏膜表達(dá)下降