電針對化療及炎癥相關疼痛的作用及機制.pdf

1、背景：
　　 針灸在中國以及其他亞洲國家的應用已有兩千多年的歷史，疼痛是針灸的主要適應癥之一。早期研究證實，針灸對腰背痛、膝關節(jié)痛等有較好療效。一個小型臨床試驗發(fā)現，針灸亦可改善腫瘤患者化療相關的神經痛癥狀。針灸鎮(zhèn)痛的機制尚未完全明了，目前，研究比較明確的是，阿片類受體是針灸鎮(zhèn)痛的主要靶點之一，進一步的實驗表明，μ和δ阿片類受體參與介導電針(EA)治療完全弗氏佐劑(CFA)和辣椒素誘導的炎性疼痛以及大鼠尾干受傷引起的神經痛，因此

2、，電針亦有可能通過阿片類受體治療化療相關神經痛。另一方面，研究數據證實，針灸可有效治療炎性疼痛，脊髓腰膨大膠質細胞分泌的細胞因子可能是其起效靶點之一，并且脊髓腰膨大星狀膠質細胞和小膠質細胞的活化被認為與炎性疼痛密切相關。白細胞介素17(IL-17)是最新發(fā)現的一類細胞因子，一般認為，其主要由TH17細胞分泌，并且主要介導自身免疫性疾病，最近的研究提示，在中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞中亦可觀察到IL-17的表達，另有研究表明，外周IL-17可介

3、導關節(jié)及神經痛，因此，脊髓腰膨大的膠質細胞中亦可能存在IL-17表達，并且其很可能與炎性疼痛相關。我們前期研究發(fā)現，脊髓腰膨大膠質細胞分泌的IL-1β等細胞因子參與介導針灸鎮(zhèn)痛。以此類推，如果脊髓IL-17參與介導炎性疼痛，那么，這種細胞因子也可能介導針灸鎮(zhèn)痛。
　　 目的：
　　 第一，研究針灸是否可以抑制化療相關神經痛以及阿片類受體是否參與介導針灸治療化療痛；第二，觀察炎性痛大鼠模型脊髓細胞是否表達IL-17，如果表

4、達，IL-17是否參與介導炎性疼痛，以及IL-17是否介導針灸鎮(zhèn)痛。
　　 方法：
　　 實驗共分為七個部分，一、電針對紫杉醇誘導的化療痛的干預作用；二、阿片類受體在電針治療化療相關疼痛中的作用；三、免疫組化法檢測IL-17及其受體在炎性痛模型大鼠脊髓中的表達；四、IL-17抗血清對炎性痛模型大鼠熱縮足閾值的影響及其對IL-17RA的表達和NR1磷酸化的調控作用；五、IL-17蛋白椎管注射對正常大鼠腳掌熱縮足閾值的影響及

5、其對IL-17RA的表達和NR1磷酸化的調控作用；六、電針對CFA誘導的痛覺過敏的作用以及電針對的脊髓IL-17、IL-17RA、p-NR1表達的影響；七、電針對IL-17誘導的痛覺過敏的作用及機制
　　 實驗一，動物隨機分為4組，即模型+假電針組(paclitaxei+shamEA)，模型+高頻電針組(paclitaxel+100Hz)，模型+低頻電針組(paclitaxel+10HzEA)，模型對照+假電針組(vehicle

6、+shamEA)，每組7只。分別于紫杉醇注射前、注射后第13天(電針前)，注射后第14、16、18、20天(每次電針后30分鐘)，采用2、4、6和15g弗萊毛檢測大鼠的機械縮足閾值。
　　 實驗二，紫杉醇腹腔注射后的動物隨機分為8組，即生理鹽水+電針組(paclitaxel+Vehicle+EA)，生理鹽水+假電針組(paclitaxel+Vehicle+sham)，CTOP+電針組(paclitaxel+CTOP+EA)，CT

7、OP+假電針組(paclitaxel+CTOP+Sham)，Naltrindole+電針組(paclitaxel+Naltrindole+EA)，Naltrindole+假電針組(paclitaxel+Naltrindole+Sham)，nor-BNI+電針組(paclitaxel+nor-BNI+EA)，nor-BNI+假電針組(paclitaxel+nor-BNI+Sham)，每組7只。三種受體阻滯劑均溶于生理鹽水，于紫杉醇注射后1

8、4、16、18和20天進行脊髓給藥，給藥后10分鐘實施電針。行為學測試同實驗一。
　　 實驗三，免疫熒光雙標法檢測模型鼠IL-17的表達。本實驗共分為兩個部分，1、CFA腳掌注射后的大鼠被隨機分為注射后2小時和24小時組，每組3只，另外3只大鼠作為對照組，于腳掌注射生理鹽水24小時后取材。大鼠脊髓腰膨大被用作免疫熒光染色，進行IL-17的計數和定位(與星狀膠質細胞標志物GFAP，小膠質細胞標志物OX-42和神經細胞標志物NeuN

9、雙標)；2、取CFA24小時組的脊髓腰膨大切片，免疫熒光雙標IL-17RA和NR1，觀察IL-17RA是否表達在含NMDAR的神經細胞上。
　　 實驗四，觀察IL-17抗血清是否可以緩解CFA引起的炎性疼痛。CFA或生理鹽水同時分別注射于不同組大鼠的左腳掌，CFA大鼠隨機分為三組，對照組，0.2或2μgIL-17抗血清組。IL-17抗血清共椎管注射三次，分別于CFA注射前24小時(阻斷IL-17的基礎分泌)，以及每次行為測試前2

10、小時(阻斷CFA誘導的IL-17分泌)，對照組在同樣的時間點椎管注射10μl生理鹽水。腳掌注射生理鹽水的大鼠與CFA大鼠采取同樣的處理。熱縮足閾值分別于CFA注射前48小時(基礎值)，以及注射后2小時、24小時檢測。行為測試完成后取大鼠脊髓腰膨大同側(CFA注射側)背角，westernblot法檢測IL-17RA、p-NR1的表達。
　　 實驗五，正常大鼠隨機分為5組，分別椎管注射10μl生理鹽水，10ng、100ng、400n

11、gIL-17或400ngIL-17+2μgIL-17抗血清，熱縮足閾值分別于CFA注射前48小時(基礎值)，以及注射后2小時、24小時、48小時檢測。因為IL-17在注射第24小時時對大鼠熱縮足閾值的影響最大，另取5組同樣處理的大鼠，于IL-17椎管注射后24小時獲取脊髓腰膨大背角，westernblot法檢測IL-17RA、p-NR1的表達。
　　 實驗六，動物隨機分為3組，模型+電針組(CFA+EA)、模型+假電針組(CFA

12、+Sham)，對照+假電針組(Saline+Sham)，每組7只。分別于CFA注射前48小時(基礎值)、注射后2小時和24小時監(jiān)測大鼠的熱縮足閾值，行為學測試完成后，免疫組化法檢測脊髓腰膨大IL-17的表達，Westernblot法監(jiān)測IL-17RA、p-NR1的表達。
　　 實驗七，動物隨機分為3組，即生理鹽水+假電針組(Saline+Sham)、IL-17+假電針組(IL-17+Sham)、IL-17+電針組(IL-17+E

13、A)，每組8只。注射后2小時和24小時監(jiān)測大鼠的熱縮足閾值，行為學測試完成后，Westernblot法監(jiān)測IL-17RA、p-NR1的表達。
　　 結果：
　　 1、紫杉醇注射后第13到第20天，施以假電針的化療痛模型大鼠對不同機械刺激的反應率明顯高于非疼痛對照組(P<0.05).與模型+假電針組相比，10Hz電針可明顯降低模型大鼠對4、8、15g弗萊毛的反應率(P<0.05)，但是100Hz電針僅對15g弗萊毛的反應率

14、有影響。
　　 2、對于椎管注射生理鹽水的化療痛模型大鼠，與假電針組相比，電針可明顯降低大鼠對不同機械刺激的反應率(P<0.05)；但是椎管注射μ阿片類受體拮抗劑(CTOP)的化療痛模型大鼠，施以電針后，與椎管注射生理鹽水的化療痛模型鼠施以假電針后對各機械刺激的反應無明顯差異(P>0.05)；對于施以假電針的化療痛模型大鼠，椎管注射CTOP與椎管注射生理鹽水無差異(P>0.05)。椎管注射δ或κ阿片類受體拮抗劑與注射CTOP的結

15、果類似。
　　 3、免疫熒光雙標法表明，IL-17在脊髓腰膨大與星狀膠質細胞標記物GFAP共表達。在CFA炎性痛大鼠模型，同側(CFA注射側)背角Ⅰ-Ⅱ層，IL-17在CFA注射后2小時、24小時計數均高于生理鹽水組(P<0.01).對側Ⅰ-Ⅱ層IL-17陽性細胞同樣輕度升高，但與生理鹽水組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在CFA注射后24小時，同側、對側Ⅰ-Ⅱ層的IL-17表達亦存在明顯差異(P=0.039).在背角Ⅴ-Ⅵ層

16、，與生理鹽水組相比，CFA注射兩小時后，雙側IL-17陽性細胞數均明顯升高(P<0.05)。CFA注射24小時后，僅同側IL-17陽性細胞數升高(P=0.034)。在背角X層，與生理鹽水組相比，IL-17在CFA注射后兩小時明顯升高(P=0.049)，但是注射后24小時無明細差異(P=0.167)。在背角Ⅲ-Ⅳ層，各組間IL-17表達無明顯差異(P>0.05)。
　　 免疫熒光雙標法表明，IL-17RA與NR1表達在同一類脊髓神

17、經細胞中
　　 4、IL-17抗血清可明顯抑制CFA炎性痛模型大鼠的熱痛覺過敏，此效應呈劑量依賴，重復測量方差分析顯示，藥物主效應(p<0.05)，時間(P<0.001)，時間和藥物交互效應(P=0.84)。組間比較顯示，與生理鹽組相比，2μgIL-17抗血清椎管注射可明顯提高炎性痛大鼠的同側熱縮足閾值(P<0.05)。IL-17對CFA注射對側腳掌無影響。
　　 Western-blot顯示，p-NR1在CFA炎性痛大

18、鼠模型脊髓背角明星升高，與非模型組(腳掌注射生理鹽水)相比。P<0.05，這種升高可被椎管注射2μgIL-17明顯抑制(P<0.05)。
　　 IL-17RA在CFA炎性痛大鼠模型脊銹背角明星升高，與非模型組(腳掌注射生理鹽水)相比，P<0.05；與椎管注射生理鹽水或0.2μgIL-17抗血清相比，2μgIL-17抗血清可使CFA炎性痛大鼠IL-17RA表達明顯降低(P<0.05)。
　　 5、IL-17椎管注射可引起大

19、鼠熱縮足閾值降低，此效應呈劑量依賴。注射400ngIL-17，在2小時后開始起效，24小時后達到峰值，48小時后恢復正常。重復測量方差分析顯示：藥物主效應(P<0.001)，時間效應(P<0.0001)，藥物和時間交互效應(P<0.05)。組間比較顯示，與生理鹽水組相比，IL-17100ng和400ng在椎管注射后第2-24小時可使大鼠熱縮足閾值明顯升高(分別為P<0.01和P<0.0001)。IL-17與IL-17抗血清聯合注射則不存

20、在這種影響。
　　 與行為學測試一致，IL-17可引起NR1磷酸化的升高，此效應呈劑量依賴。IL-17抗血清可阻斷這種效應。
　　 同樣，IL-17可引起IL-17RA的升高，此效應呈劑量依賴。IL-17抗血清可阻斷這種效應。
　　 6、熱縮足閾值測試結果顯示，與假電針組相比，電針實施后2-24小時可有效抑制CFA引起的痛覺過敏。重復測量方差分析結果顯示：CFA注射同側，藥物主效應(P<0.01)，時間效應(P<

21、0.01)，藥物和時間交互效應(P<0.01).組間比較顯示，與生理鹽水組相比，CFA第2-24小時可使大鼠熱縮足閾值明顯降低(P<0.01)。電針可顯著抑制這種降低(P<0.05)。CFA注射對對側腳掌的熱縮足閾值無顯著影響，各組間比較(P>0.05)
　　 與非模型組相比，假電針組炎性痛模型大鼠的IL-17，P-NR1和IL-17RA表達水平均明顯升高(P<0.05)。電針可顯著抑制這種升高(P<0.05)。
　　

22、7、熱縮足閾值測試結果顯示(雙側平均值)，與假電針組相比，電針實施后2-24小時可有效抑制IL-17椎管注射引起的痛覺過敏。重復測量方差分析結果顯示：治療主效應(P<0.01)，時間效應(P<0.01)，藥物和時間交互效應(P<0.01).組間比較顯示，與生理鹽水組相比，IL-17第2-24小時可使大鼠熱縮足閾值明顯降低(P<0.01)。電針可顯著抑制這種降低(P<0.05)。
　　 與非模型組相比，椎管注射IL-17的假電針組

23、大鼠的p-NR1和IL-17RA表達水平均明顯升高(P<0.05)。電針可顯著抑制這種升高(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、電針可通過上述三種阿片類受體有效抑制化療引起的神經痛；電針可做為化療相關疼痛的一種有效替代治療手段。
　　 2、脊髓星狀膠質細胞可表達IL-17，脊髓IL-17可通過誘導NR1的磷酸化引起炎性疼痛。
　　 3、電針可通過抑制脊髓IL-17的表達緩解炎性疼痛。