電針對CSCI脫髓鞘病變的修復作用及其機制研究.pdf

1、脊髓壓迫性損傷（compressedspinalcordinjury,CSCI）是脊柱外科的常見病和多發(fā)病。椎骨骨折、脊柱結核、黃韌帶硬化、髓內腫瘤、硬膜外血腫等均可造成CSCI。CSCI后，脊髓白質發(fā)生脫髓鞘病變，是導致神經(jīng)功能障礙的主要原因之一。其臨床表現(xiàn)為損傷平面以下運動障礙、感覺及括約肌功能部分或全部障礙，如未能及時治療，將導致不可逆的功能缺失，對患者的身心健康造成嚴重的傷害，給患者的家庭以及整個社會帶來極大的負擔。因此，對CS

2、CI誘導的脫髓鞘病變機制及其治療的研究具有十分重要的意義，已成為神經(jīng)科學領域的研究熱點。
　　近年來，臨床上治療CSCI的技術方法有激素沖擊治療、神經(jīng)營養(yǎng)因子的補充、組織工程支架的應用以及干細胞移植等，均取得一定療效，但存在著費用昂貴、副作用大、細胞的來源有限以及社會倫理等各種問題。相反，與現(xiàn)代醫(yī)學的藥物和手術療法相比，電針（electroacupuncture,EA）具有安全、簡便、無副作用等優(yōu)點，成為目前治療脊髓損傷的一種有效

3、的治療手段，已引起醫(yī)學界的廣泛關注。但是，由于電針作用機理目前尚不清楚，阻礙了針灸在脊髓創(chuàng)傷領域的深入發(fā)展和廣泛應用。目前，關于CSCI誘導的脫髓鞘病變和電針在促髓鞘修復的作用機制的相關報道較少，值得進一步深入研究。
　　為此，本項目擬在制作CSCI模型的基礎上，采用透射電鏡、激光共聚焦、免疫印跡等分子生物學技術，從CSCI誘導的脫髓鞘病變機制以及電針對CSCI脫髓鞘病變保護的作用機制兩方面進行研究。本研究結果將為闡明CSCI脫髓

4、鞘病變機制以及電針對脫髓鞘病變的作用機理提供實驗依據(jù)，具有重要的學術意義和臨床應用價值。
　　目的：
　　1、探討大鼠CSCI脫髓鞘病變的相關病理機制。
　　2、CSCI后，采用電針治療，研究電針對脫髓鞘病變的修復作用及其機制。
　　方法：
　　1、成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，隨機分為正常組（n=20）、假手術組（n=20）與模型組（n=60）。正常組給予常規(guī)飲食，不作任何干預

5、；假手術組僅做椎板切除術，不施壓；模型組又分為1、3、7d三個時間點，采用自行研制的壓迫器制作脊髓壓迫模型。運用BBB(Basso,Beattie,andBresnahan,BBB)運動功能評分評價大鼠后肢運動功能；通過鋨酸染色和透射電鏡檢測CSCI后1、3、7d白質有髓神經(jīng)纖維結構的變化，并計算脊髓后索有髓神經(jīng)纖維數(shù)量以及G-ratio值（髓鞘厚度與軸突直徑的比值）；通過原位細胞凋亡（TdTmediateddUTP-biotinnic

6、kendlabeling，TUNEL)試劑盒于壓迫1、3、7d后檢測少突膠質細胞凋亡情況；運用免疫熒光雙標和蛋白質印跡技術觀察Caspase-12、CytochromeC、Id2以及MBP的表達變化。
　　2、將72只SD大鼠分為對照組（n=36）和電針組（n=36），根據(jù)治療時間分別分為3、7、14d3個亞組。電針組于造模后，針刺大鼠雙側足三里和雙側太溪穴，并于雙側足三里和太溪穴進行電針刺激（連續(xù)波，輸出頻率為2Hz，電壓1.5

7、V，30min）；對照組只造模，不治療。在不同治療時間點采用BBB進行動物后肢運動功能評分，并運用電鏡觀察脊髓損傷節(jié)段髓鞘的超微結構以及計算G-ratio值；采用5-乙炔基-2-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）染色檢測少突膠質細胞、少突膠質前體細胞（Oligodendrocyteprecursorcells，OPCs）、星形膠質細胞增殖情況；采用免疫印跡技術和免疫熒光雙標檢測Id2和少突膠質細胞轉錄

8、因子（Oligodendrocytelineagegene2，Olig2）分別在OPCs里的表達變化；運用免疫印跡技術檢測Caspase-12、CytochromeC、MBP以及OPCs標記物NG2的表達變化。
　　3、用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析。
　　結果：
　　1、大鼠后肢運動功能評定結果顯示：正常組和假手術組大鼠后肢運動功能BBB評分為21分，模型組的BBB分值均明顯下降，與正常組和假手術組相比，差

9、異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在壓迫7d后BBB分值降至最低（P＜0.05）。鋨酸染色結果顯示：正常組和假手術組白質均正常；CSCI后，模型組的有髓神經(jīng)纖維逐漸出現(xiàn)水腫、變性、崩解等潰變；隨著壓迫時間延長，模型組的纖維數(shù)量逐漸減少，在壓迫后第7d，有髓神經(jīng)纖維數(shù)量減至最低(P＜0.05）。電鏡結果顯示：正常組和假手術組的軸突、髓鞘板層結構正常；脊髓受壓后，模型組的軸索腫脹，軸漿內細胞器變性、缺失；髓鞘發(fā)生折疊、皺縮，出現(xiàn)“洋蔥皮”樣變

10、，逐漸崩解、變薄；少突膠質細胞的染色質凝聚；隨著壓迫時間延長，模型組的G-ratio值逐漸下降，在壓迫后第7d，G-ratio降至最低（P＜0.05）。TUNEL結果顯示：CSCI后第1d即出現(xiàn)少突膠質細胞的凋亡，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并隨著壓迫時間延長，模型組凋亡的少突膠質細胞數(shù)目逐漸增多，在第7d達到高峰（P＜0.05）。免疫熒光雙標結果顯示：正常組和對照組的caspase-12+-CNPase細胞、Cyt

11、ochromeC+-CNPase細胞以及Id2+-CNPase細胞數(shù)目較少，在白質里散在分布；CSCI后，隨著壓迫時間延長，各時間點均有caspase-12+-CNPase細胞、CytochromeC+-CNPase細胞以及Id2+-CNPase細胞，并逐漸增多，廣泛分布在白質里。免疫印跡法結果顯示：正常組、對照組胞漿Caspase-12、CytochromeC、Id2蛋白表達水平較低；隨著受壓時間延長，在壓迫后第7d三者蛋白水平均達到

12、峰值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。正常組MBP蛋白表達水平最高；隨著脊髓壓迫的時間延長，模型組的MBP蛋白表達量逐漸下降，在壓迫后7d表達最低（P＜0.05）。
　　2、電針干預后，BBB評分結果顯示：3、7d對照組和電針組組間及組內相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），14d電針組分別與7d電針組及同時期的對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同時間點的對照組均有程度不等的軸突腫脹，軸漿內細胞器變性、丟失，

13、髓鞘出現(xiàn)水腫，髓鞘板層結構紊亂、增厚，直至潰變、崩解；電針組的髓鞘、軸突腫脹程度比同時期的對照組略輕，髓鞘結構較為致密。G-ratio值顯示，3、7d對照組和電針組組間及組內相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），14d電針組分別與7d電針組及同時期的對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。EdU染色檢測結果顯示：電針組的EdU+-NG2細胞和EdU+-CNPase細胞數(shù)目隨著治療時間延長逐漸增多，在治療14d后，EdU+-N

14、G2細胞和EdU+-CNPase細胞數(shù)目達到最大值（P＜0.05），和同時間點的對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；EdU+-GFAP細胞數(shù)目隨著治療時間延長也逐漸增多，但和同時間點的對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組和電針組的Id2+-NG2細胞在治療初期廣泛分布于白質里，隨著治療時間延長，兩組的Id2+-NG2細胞在白質里逐漸散在分布，兩組的Id2蛋白表達水平隨時間延長均逐漸下降，在治療14d后降至最低

15、值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組和電針組的Olig2+-NG2細胞在治療初期散在分布于白質里，隨著治療時間延長，兩組的Olig2+-NG2細胞在白質里逐漸廣泛分布，兩組的Olig2蛋白表達水平隨時間延長均逐漸增加，在治療14d后達到最大值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫印跡結果顯示：對照組和電針組的Caspase-12和CytochromeC表達

16、隨著治療時間延長逐漸下降，在治療14d后降至最低值（P＜0.05），同時間點的兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組和電針組的MBP和NG2蛋白表達隨時間延長均逐漸上調，在治療14d后達到最大值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1、CSCI后，有髓神經(jīng)纖維發(fā)生脫髓鞘病變，隨著壓迫時間延長，潰變進行性加重，導致運動功能缺損，脫髓鞘病變的病理機制與少突膠質細胞

17、凋亡以及MBP的崩解密切相關。而少突膠質細胞凋亡又與Caspase-12表達增強、CytochromeC釋放以及Id2表達上調三者共同作用有關。
　　2、CSCI后，電針刺激可改善大鼠運動功能，其作用機制主要是下調Id2、增強Olig2的表達，促進OPCs和少突膠質細胞的增殖、分化成熟以幫助再髓鞘化；同時抑制Caspase-12表達和CytochromeC的釋放，減少少突膠質細胞的死亡，以此減輕脫髓鞘病變癥狀，幫助受損神經(jīng)纖維實現(xiàn)