山茱萸環(huán)烯醚萜苷對EAE大鼠炎性脫髓鞘的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失為主要病理特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制不明。目前較多認(rèn)為MS是由于自身免疫反應(yīng)引起的神經(jīng)炎癥攻擊神經(jīng)纖維髓鞘導(dǎo)致髓鞘脫失，進(jìn)一步抑制髓鞘的再生與修復(fù)。本室（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京）既往研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜苷(CIG)具有抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用，并且可以促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，對髓鞘具有保護(hù)作用，因此，我們推測CIG可能通過抑制中樞炎

2、癥反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)作用，從而對MS有一定的治療作用。
　　 目的:在多發(fā)性硬化動物模型上，即實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimental allergy encephalomyelitis，EAE)上研究CIG對髓鞘再生的作用以及其作用機(jī)制，為開發(fā)治療多發(fā)性硬化的新藥提供實驗根據(jù)。
　　 方法:將豚鼠MBP68-86多肽片段與結(jié)核分枝桿菌、不完全弗氏佐劑乳化后于兩后足掌皮下多點一次性注射200μl免疫雌性Le

3、wis大鼠制備EAE模型。三個給藥組（30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg）和藥物對照組(60 mg/kg)分別灌胃給予山茱萸環(huán)烯醚萜苷3周，每日觀察并記錄大鼠的行為學(xué)變化，監(jiān)測動物的體重變化，采用油紅O染色觀察大鼠腦組織中的髓鞘形態(tài)變化。用免疫組化的方法測定脊髓內(nèi)反應(yīng)性T細(xì)胞（CD3標(biāo)記）、小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1標(biāo)記)、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體(NG2標(biāo)記)、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（GSTP-i標(biāo)記）和腦源性營養(yǎng)因子(Brain-

4、derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá);Western blot檢測大腦皮層中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、以及IκB的表達(dá)，以及可能的炎癥通路JAK/STAT通路中關(guān)鍵指標(biāo)STAT1/p-STAT1、STAT3/p-STAT3、IL-6及其受體的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1)免疫后，各組大鼠體重在免疫后第1天均有所降低，模型組大鼠的體重從第8天開始明顯下降，至第12天與對照組大鼠相比顯著降低

5、（具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義），且第10天開始模型大鼠出現(xiàn)運動功能障礙，如尾部張力消失、后肢癱瘓等行為學(xué)改變。在第13天行為學(xué)評分到達(dá)高峰。灌胃給予CIG后觀察大鼠的體重和行為學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，CIG雖然不能明顯對抗大鼠的體重下降，但可以延遲神經(jīng)功能損傷的發(fā)病進(jìn)程，緩解其發(fā)病癥狀。
　　 2)油紅O染色觀察形態(tài)學(xué)變化，EAE模型大鼠腦內(nèi)油紅O染色顯示炎癥細(xì)胞浸潤，輕微的髓鞘脫失。給藥后，炎性浸潤消失，且髓鞘脫失減弱。
　　 3)免疫

6、組化觀察大鼠脊髓內(nèi)反應(yīng)性T細(xì)胞（CD3標(biāo)記）、小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1標(biāo)記)的變化發(fā)現(xiàn)，EAE模型大鼠脊髓內(nèi)反應(yīng)性T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，CIG給藥后，反應(yīng)性T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量劑量依賴性的減少，表明CIG可抑制反應(yīng)性T細(xì)胞增生、小膠質(zhì)細(xì)胞的異常活化，降低免疫反應(yīng)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，EAE模型大鼠脊髓中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)減少(P＜0.05)，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量下降(P＜0.05)，而少突膠質(zhì)細(xì)胞前體增加(

7、P＜0.05)，給藥組（60和120mg/kg）大鼠脊髓中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞均劑量依賴性增加，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體則逐漸減少，這種結(jié)果暗示CIG可能具有促進(jìn)神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，且促使少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的作用，有助于髓鞘再生修復(fù)。
　　 4)EAE模型大鼠腦組織中p-STAT1、p-STAT3的表達(dá)與對照組相比明顯增加(P＜0.05)，而STAT1、STAT3的表達(dá)則沒有變化，灌胃給予C

8、IG后，給藥組(30，60和120 mg/kg) p-STAT1、p-STAT3在腦內(nèi)的表達(dá)劑量劑量依賴性降低。
　　 5)EAE模型大鼠腦組織中炎性因子IL-6的表達(dá)增加（與對照組相比，P＜0.05），但其受體的表達(dá)沒有變化，灌胃給予CIG，IL-6在腦內(nèi)的表達(dá)相比模型組明顯下降，并就有異性的劑量依賴性。
　　 6)此外，炎性因子NF-κB的表達(dá)在EAE模型組也有顯著性的增加(P＜0.05)，但其抑制蛋白IκB表達(dá)沒有

9、改變，灌胃給予CIG后，NF-κB在腦內(nèi)的表達(dá)隨著給藥劑量的增加而減少，但對IκB表達(dá)沒有影響。
　　 結(jié)論:中藥有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷(CIG)能夠有效降低EAE模型中的炎性浸潤，減輕髓鞘脫失，對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型組的神經(jīng)功能障礙具有一定的治療作用。這種作用可能是通過抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕其對中樞髓鞘的直接損傷，而其機(jī)制可能是JAK/STAT信號途徑;此外，CIG還能促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)髓鞘再生，修復(fù)神