獨(dú)一味環(huán)烯醚萜苷對大鼠炎癥性腸病的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗?zāi)康模貉芯开?dú)一味環(huán)烯醚萜苷（IGLR）對大鼠急性IBD模型的治療作用；為將IGLR開發(fā)成為治療IBD的有效新藥提供實(shí)驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗方法：
　　1分組：將90只Wistar大鼠隨機(jī)分成9組：正常對照組（C）、TNBS模型對照組（M1）、TNBS模型的IGLR高、中、低（300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg）三種劑量治療組（T1h、T1m、T1l）、柳氮磺吡啶（SASP）陽性對照組（S1）， DS

2、S模型對照組（M2）、 DSS模型的IGLR300mg/kg治療組（T2）、SASP陽性對照組（S2）。
　　2大鼠IBD模型制作：用TNBS-無水乙醇（1:1）溶液一次性灌腸誘導(dǎo)大鼠TNBS性IBD模型；給予6％DSS溶液自由飲用8天誘導(dǎo)大鼠DSS性IBD模型；C組以等量蒸餾水灌腸或飲用。
　　3給藥和結(jié)果觀察：造模完成后次日開始灌胃給藥，各對照組給等容積蒸餾水，期間觀察大鼠活動、大便性狀及隱血檢測；連續(xù)處理7天后處死大鼠

3、，取結(jié)腸組織標(biāo)本，觀察記錄各組大鼠結(jié)腸病變；HE染色光鏡下觀察各組組織學(xué)改變并進(jìn)行組織學(xué)評分；取結(jié)腸標(biāo)本做分子生物學(xué)機(jī)制研究。
　　4分子生物學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測：采用IHC法檢測結(jié)腸組織MPO及EPO的表達(dá)；采用ELISA法檢測血清標(biāo)本中INF-γ、IL-4、IL-10及IL-17的表達(dá)；采用Western Blot法及RT-PCR法檢測結(jié)腸組織中GATA-3、T-bet、Foxp3、ROR-γt蛋白及其mRNA的表達(dá)。
　　實(shí)

4、驗結(jié)果：
　　1一般狀況：M1，T1l組大鼠實(shí)驗期間期間毛發(fā)豎立，進(jìn)食、飲水及活動顯著減少，體重明顯下降，腹脹，無排便，DAI呈較恒定高水平，與M1相比，S1、T1m及T1h大鼠在給藥第2-4天起開始排便，體重回升，一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，給藥兩天后起，DAI呈明顯下降趨勢；M2組大鼠在實(shí)驗期間一般狀況差，出現(xiàn)大量稀便及膿血便，體重明顯降低，DAI呈持續(xù)高水平，無明顯下降，與M2相比S2、T2組于治療開始后2-3天基本無肉眼血便，6-7

5、天時大便呈梭形固體顆粒，隱血（-），體重逐漸恢復(fù)，但未達(dá)C組水平，給藥后3天起DAI下降趨勢明顯。
　　2結(jié)腸組織大體形態(tài)及組織學(xué)改變：結(jié)腸組織肉眼觀察表明，M1組存在大片腸壁潰瘍，部分節(jié)段腸壁僵硬，完全失去活性，組織學(xué)評分與C組差異顯著（p<0.05）,T1l組有一定緩解，但不明顯，S1、T1h及T1m潰瘍面明顯縮小，仍存在部分小片及點(diǎn)狀潰瘍，評分與M1存在顯著差異（p<0.05）；M2組大鼠結(jié)腸壁潰瘍、水腫、充血嚴(yán)重，有明顯出

6、血灶及血絲，評分與C組相較差異顯著（p<0.05），S2及T2組結(jié)腸壁潰瘍、水腫、充血、出血明顯減少，存在少量出血點(diǎn)，與M2相比評分下降具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　　HE染色后光鏡下可見M1組腸壁組織破壞深達(dá)肌層，大量組織壞死及炎癥細(xì)胞浸潤；與M1組相較，S1、T1l、T1h及T1m組有不同程度緩解，呈劑量依賴性；M2組可見腸黏膜細(xì)胞腫脹壞死，但損傷未達(dá)肌層，S2及T2可見炎癥修復(fù)和及再生的腺體及杯狀細(xì)胞。與C組相比，M1

7、、M2組織學(xué)評分顯著升高（p<0.05），而各治療組均呈顯著下降（p<0.05）。
　　3 HIC檢測MPO及EPO：與C組對照，M1及M2組大鼠結(jié)腸潰瘍組織處MPO及EPO均表達(dá)增強(qiáng)，呈棕黃色深染，其主要分布于胞漿內(nèi)，炎癥致細(xì)胞破壞后，MPO及EPO大量溢出，檢測評分結(jié)果升高顯著（p<0.05）。經(jīng)IGLR和SASP處理7天后，與M1或M2組相比，各給藥組大鼠結(jié)腸病變區(qū)MPO及EPO均表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的降低（p<0.05）。<

8、br>　　4 ELISA檢測血清蛋白：檢測結(jié)果顯示，與C組相比，INF-γ及IL-17在M1、M2組中均有顯著升高，IL-10則顯著下降，IL-4僅在M2中出現(xiàn)明顯下降（ p<0.05）；治療后，各治療組INF-γ均出現(xiàn)顯著下降（p<0.05），IL-10均出現(xiàn)顯著上升（p<0.05），IL-17在S1、T1m、T1h、S2及T2組中出現(xiàn)明顯下降（p<0.05），在TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病模型中IL-4無顯著變化，而在DSS模型的治療組

9、S2、T2中有明顯回升（p<0.05）。
　　5結(jié)腸潰瘍組織蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)：檢測結(jié)果提示，與C組對照，M1及M2組在潰瘍組織處T-bet和ROR-γt的蛋白及mRNA表達(dá)均顯著提升（p<0.05），經(jīng)過治療，T2、S2、T1m及T1h均出現(xiàn)顯著下降（p<0.05）；GATA-3蛋白及mRNA在M1組中表達(dá)量改變不顯著，而在M2組中明顯上升（p<0.05），治療后T2、S2及T1h出現(xiàn)表達(dá)量下降，其該變量具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0

10、.05）；Foxp3的表達(dá)在M1及M2組中均顯著降低（p<0.05），而與之相比，所有治療組表達(dá)均出現(xiàn)明顯升高（p<0.05）。
　　實(shí)驗結(jié)論：
　　1 TNBS誘導(dǎo)的大鼠IBD模型主要表現(xiàn)為腹脹、便秘及體重急劇下降，嚴(yán)重的結(jié)腸炎性反應(yīng)，大片結(jié)腸壁潰瘍，部分節(jié)段腸壁僵硬，潰瘍深達(dá)肌層，其免疫病理學(xué)改變以Th1及Th17細(xì)胞因子作用為主導(dǎo)；DSS誘導(dǎo)的大鼠IBD模型以腹瀉、膿血便及體重急劇下降為主要表現(xiàn)，結(jié)腸炎性反應(yīng)嚴(yán)重，潰瘍

11、主要損傷結(jié)腸黏膜層，以水腫、出血為主，鏡下可見腺窩缺損和杯狀細(xì)胞破壞，其免疫病理學(xué)改變可能包括Th1、Th2及Th17細(xì)胞因子等的共同作用。
　　2 IGLR對TNBS及DSS誘導(dǎo)的兩類大鼠IBD模型均有顯著療效，可有效抑制IBD的炎癥反應(yīng)和結(jié)腸損傷。
　　3 IGLR對大鼠IBD治療作用的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Th1、Th2及Th17細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3及RORγt的表達(dá)，抑制其炎癥反應(yīng)及結(jié)腸損傷而產(chǎn)生