山茱萸總苷及多糖對實驗性心肌梗死大鼠線粒體保護作用及機制探析.pdf

1、研究背景：
　　 急性心肌梗死(acute myocardial infarction)系指冠狀動脈突然完全性閉塞，心肌發(fā)生缺血、損傷和壞死，出現(xiàn)以劇烈胸痛、心電圖和心肌酶學(xué)的動態(tài)變化為臨床特征的一種急性缺血性心臟病。是臨床危重疾病之一。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性心肌梗死多在正氣內(nèi)虛的基礎(chǔ)上因勞逸不當(dāng)、恣食膏粱厚味，或七情內(nèi)傷等因素而致病，腎陰腎陽虧虛貫穿疾病的發(fā)生始終。目前在冠心病急性心肌梗死的治療上，西藥及介入治療的研究較多，一些中藥

2、在穩(wěn)定型心絞痛治療中的作用亦得到肯定，但有關(guān)研究多集中在活血化瘀行氣止痛的中藥上，對于補腎固脫的藥物在急性心肌梗死時的預(yù)防及保護作用及機制研究非常少。山萸肉具有補益肝腎、澀精固脫之功效，它在搶救危重冠心病時顯示出優(yōu)越的療效。而冠心病急性心肌缺血時線粒體能量耗竭、誘導(dǎo)凋亡及活性氧釋放損傷是重要的病理變化。因此我們推斷，線粒體與補腎法之間存在著微妙的聯(lián)系。我們通過研究急性心肌梗死前后及山茱萸有效成分治療前后線粒體的功能、結(jié)構(gòu)，數(shù)量的變化，希

3、望能夠揭示補腎法的本質(zhì)。
　　 目的：
　　 我們早期的研究已經(jīng)證實，補益肝腎，澀滑固脫的山萸肉對于急性心肌梗死模型的大鼠的心肌具有保護作用，能夠改善大鼠的心功能、縮小心肌梗死面積，有可能是通過抗氧化損傷，抗炎途徑來實現(xiàn)的，本實驗在此基礎(chǔ)上，通過研究急性心肌梗死后的心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量、結(jié)構(gòu)與功能的變化，探討山茱萸對心肌梗死大鼠心肌線粒體保護作用的機制，以期說明補腎法的作用本質(zhì)。
　　 方法：
　　 SPF

4、級SD大鼠總共為93只，體重為220-250g。按照文獻報道造模死亡率(40-50％)，保證最后各組動物數(shù)大致一致，將33只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組與預(yù)防給藥組，另外60只SD大鼠采取開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法，建立急性心肌梗死的模型，術(shù)后24h內(nèi)存活的38只大鼠隨機分為模型組、山茱萸多糖治療組、山茱萸總苷治療組。其中假手術(shù)組僅在冠狀動脈部位只穿線不結(jié)扎，其余四組均在相同部位結(jié)扎。各組建立相同的觀察起點和終點，均在實驗的第8天造模，

5、術(shù)后或術(shù)前給藥7天，總觀察時間為15天。最終實驗結(jié)束共存活58只大鼠，并獲取完整資料如下。
　　 ①假手術(shù)組12只(術(shù)前與術(shù)后分別給生理鹽水七天)
　　 ②心肌梗死對照組10只(給藥同假手術(shù)組)
　　 ③預(yù)防給藥組12只(術(shù)前給山茱萸總苷七天，術(shù)后給生理鹽水七天)
　　 ④山茱萸多糖治療組12只(術(shù)前給生理鹽水七天，術(shù)后給山茱萸多糖七天)
　　 ⑤山茱萸總苷治療組12只(術(shù)前給生理鹽水七天，術(shù)后給

6、山茱萸總苷七天)
　　 觀察結(jié)束后，每組隨機選取一半動物分別進行超聲心動圖及血流動力學(xué)檢測評價心功能，然后腹主動脈取血檢測血清氧化損傷和抗氧化損傷標(biāo)志物MDA、MPO及SOD、GSH-Px含量，同時留取心臟標(biāo)本，馬上分離心肌細(xì)胞進行線粒體膜電位檢測△ψm(細(xì)胞早期凋亡指標(biāo))，切片行病理學(xué)檢測、Masson三色染色法進行心肌梗死面積測定，普通石蠟切片進行心肌細(xì)胞凋亡率TUNEL檢測(細(xì)胞晚期凋亡指標(biāo))，并每組留取半數(shù)心臟標(biāo)本液氮保

7、存，檢測心肌組織凋亡相關(guān)基因FAS/FASL、BAX/BCL-2mRNA表達及線粒體發(fā)生相關(guān)基因PGC-1α、PGC-1β，NRF-1mRNA表達，GSK-3βmRNA及蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 線粒體保護相關(guān)檢測-凋亡與線粒體發(fā)生
　　 早期凋亡指標(biāo)山茱萸對大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響：與假手術(shù)組相比，預(yù)防給藥組、山茱萸多糖組、山茱萸總苷組和模型組線粒體膜電位下降的心肌細(xì)胞數(shù)增加，即凋亡細(xì)胞數(shù)增加，差別

8、有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，預(yù)防給藥組、山茱萸多糖組和山茱萸總苷組的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；但是山茱萸多糖和山茱萸總苷、預(yù)防給藥三組比較，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 晚期凋亡指標(biāo)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)：與假手術(shù)組相比，預(yù)防給藥組、山茱萸多糖組、山茱萸總苷組和模型組凋亡細(xì)胞率增多，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，預(yù)防給藥組、山茱萸多糖組和山茱萸總苷組心肌細(xì)胞凋亡率減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；但是山茱萸多糖和山茱萸總苷、預(yù)防給藥三

9、組比較，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 心肌凋亡相關(guān)基因BCL-2/BAX，F(xiàn)AS/FASLmRNA表達的影響與假手術(shù)組相比，預(yù)防給藥組、山茱萸多糖組、山茱萸總苷組和模型組促凋亡基因BAX、FAS和FASL表達增加，抗凋亡基因BCL-2表達減少，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；山茱萸多糖能夠顯著降低促凋亡基因FAS的表達，與其他各組相比，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；山茱萸總苷能夠顯著降低促凋亡基因BAX的表達，升高抗凋亡基因BCL-2的表達，與其他各組相比

10、，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 線粒體生物發(fā)生的相關(guān)基因PGC1α與PGC1β，NRF-1mRNA表達的影響與模型組相比，預(yù)防給藥組、總苷治療組，多糖治療組的PGC1α(過氧化物酶體增殖物受體r共激活因子1α)與PGC1β(過氧化物酶體增殖物受體r共激活因子1β)，NRF-1(細(xì)胞核呼吸因子1)mRNA表達都有明顯下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明在藥物的干預(yù)下線粒體的結(jié)構(gòu)與功能都對缺血有適應(yīng)性變化；并且在預(yù)防給藥組顯示出對線粒體發(fā)生

11、相關(guān)基因非常明顯的升高作用，比山茱萸總苷和山茱萸多糖治療組都好，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 心肌GSK-3βmRNA和GSK-3β蛋白表達的影響與假手術(shù)組相比，模型組、預(yù)防給藥組、總苷治療組，多糖治療組的GSK-3βmRNA及蛋白表達都有明顯的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明急性心肌梗死后GSK-3β參與心肌損傷的過程；與模型組相比，總苷治療組、多糖治療組、預(yù)防給藥組的GSK-3βmRNA表達都有明顯降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，藥物

12、治療具有降低GSK-3β，保護心肌細(xì)胞的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.山茱萸有效成分具有保護心肌梗死大鼠心功能、縮小大鼠心肌梗死面積
　　 2.山茱萸可以保護線粒體的功能，改善線粒體的質(zhì)和量，提高心肌細(xì)胞耐缺血缺氧的能力：
　　 線粒體質(zhì)的改善---山茱萸多糖有可能作用于膜受體途徑引起的心肌細(xì)胞凋亡，能夠顯著降低促凋亡基因FAS的表達；山茱萸總苷可能作用于線粒體途徑引起的心肌細(xì)胞凋亡，能夠顯著降低促凋亡